Оптимизация элементов методики клонального микроразмножения смородины красной (Ribes rubrum L.) с учетом генотипических особенностей

Полный текст

Производство конкурентоспособного посадочного материала сельскохозяйственных культур в промышленных масштабах затруднительно без применения метода микроклонального размножения. Успешность технологии связана с физиологическими особенностями исходного материала, генотипом, минеральным составом питательной среды, содержанием витаминов. [19]

Выбор срока введения в культуру in vitro остается открытым, поскольку нет единого мнения о том, какой период может обеспечить наиболее высокий процент выхода стерильных жизнеспособных растений. Важно учитывать сезонность ростовых процессов в растениях, поэтому стоит корректировать сроки извлечения меристем для каждого вида и сорта индивидуально. [1, 17] Для многих ягодных культур эффективная регенерация эксплантов отмечается при введении в фазе активного роста. [4, 15] Некоторые исследователи выбирают фазу вынужденного покоя со спящими почками или почки в осенний период, когда ростовые процессы замедляются. [6, 9, 10, 15]

Питательная среда служит основным источником минералов, витаминов и других компонентов для функционирования микрорастений в культуре in vitro. Асептическая изоляция и культивирование ограничивает пути получения нужных растениям нутриентов, поэтому культуральная среда должна включать все необходимое для полноценного развития экспланта.

Минеральную основу среды подбирают индивидуально для вида и сорта растения, по этой причине не стоит исключать влияние генотипа. Специфическая реакция на состав среды может быть связана с генетическим контролем метаболизма гормонов в растении. [17] Каждый вид имеет свой состав элементов, поэтому его можно использовать для подбора среды и перекрытия дефицита тех или иных соединений. [16] В качестве минеральной основы применяют среду по прописи Murashige-Skoog (MS) (1962), модифицируя ее в зависимости от этапа культивирования. Сравнение среды MS с элементным составом побегов хорошо растущих растений показало низкое содержание катионов Ca²⁺, Cu²⁺, P⁵⁺, Mg²⁺ и высокое анионов Cl^- и Mo⁶⁺. Большое количество неорганического азота в данной питательной среде способствовало формированию органов микрорастения. Помимо среды MS, существуют опыты с применением других минеральных основ для культивирования in vitro: McCown (WPM) (1981), Anderson (1984), Lee и de Fossard, Quorin–Lepoivre (1977) и другие.

Приживаемость и рост эксплантов зависит не только от солевого состава питательной среды, но и регуляторов роста, в основном цитокинов и ауксинов. [2] Наиболее подходящие условия для получения высоких побегов смородины красной были созданы на MS с минеральным составом ¹/₂ концентрации и содержанием БАП 0,4 мг/л, ИМК 0,02 мг/л и ГК 0,2 мг/л. [19]

Преодолеть критические моменты при воспроизводстве микрорастений помогает использование биологически активных веществ. [8] Витамины вместе с другими составляющими среды влияют на онтогенез растения, включая образование корней, формирование и рост каллуса, способность адаптироваться к стрессовым условиям. [12, 18] Доказано, что витамины работают как индукторы устойчивости к болезням, что привлекает внимание производителей из-за безопасности и экономической эффективности при их применении. [13] Дефицит витаминов, передозировка или дисбаланс – проблема для растений. [20]

В исследованиях по микроклональному размножению нет точных данных о концентрации витаминов в среде, которая бы обеспечила эксплантам полноценное развитие. В большинстве опытов по культивированию in vitro в состав питательной среды вносят витамины группы B (B₁, B₆, B₈, B₁₂), аскорбиновую кислоту (витамин С), никотиновую кислоту (РР). [7, 11]

Цель работы – изучение эффективности микроклонального размножения смородины красной в зависимости от срока изоляции меристем, генотипических особенностей сортов и органического состава питательной среды на различных этапах культивирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили в 2022–2023 годах согласно общепринятым методикам на базе лаборатории биотехнологии ВНИИ селекции плодовых культур (ВНИИСПК). [3, 6, 15]

Объект изучения – сорта смородины красной селекции ВНИИСПК (табл. 1).

 

Таблица 1. Объекты исследования и их характеристика

Сорт	Происхождение
	генетическое	видовое
Валентиновка	Rote Spatlese × Jonkheer Van Tets	R. rubrum L. R. multiflorum Kit.
Вика	Чулковская × Red Lake	R. vulgare Lam.
Газель	Чулковская × Maarses Prominent	R. vulgare Lam.

 

Выводили в культуру in vitro в два периода – апрель и июнь. Характеристику климатических условий осуществляли с использованием данных метеонаблюдений с января 2022 года по декабрь 2023, полученных на метеорологической станции ВНИИСПК (рис. 1).

 

Рис. 1. Климатические условия в годы проведения исследований.

 

Исходный материал в весенний период (выход из покоя) – почки однолетних одревесневших побегов. Для стимуляции процесса выхода из состояния покоя побеги помещали в сосуд с водой и выдерживали при температуре 22 … 24°С до появления зеленого конуса. В летний период источниками эксплантов служили почки растущих зеленых побегов.

Перед введением в культуру in vitro была ступенчатая стерилизация растительного материала с применением ртути двухлористой (HgCl₂) в концентрации 0,1% с экспозицией 10 мин. [9]

Для культивирования полученных из почек меристематических верхушек использовали варианты питательной среды MS с разным соотношением биологических активных веществ, дополненные аскорбиновой кислотой (10 мг/л) и тройным количеством хелата железа:

1. этап инициации культуры: MS + 6-БАП (0,2 мг/л) + витамины B₁ (0,5 мг/л), B₆ (0,5 мг/л), PP (0,5 мг/л) – контроль (MS); MS₁ + 6-БАП (0,2 мг/л) + витамины B₁ (0,1 мг/л), B₆ (0,5 мг/л), PP (0,5 мг/л) (MS₁); MS₂ + 6-БАП (0,2 мг/л) + витамины B₁ (10,0 мг/л), B₆ (10,0 мг/л), PP (5,0 мг/л) (MS₂).
2. этап размножения: MS + 6-БАП 0,8 мг/л (MS₃); MS + 6-БАП 0,5 мг/л, ИМК 0,1мг/л, ГК 0,1мг/л (MS₄) (варианты сред на фоне витаминов B₁ (0,5 мг/л), B₆ (0,5 мг/л), PP (0,5 мг/л).

Степень влияния сорта, климатических условий периода введения на физиологическое состояние исходного материала, состава питательной среды на результативность инициации культуры in vitro оценивали с использованием коэффициента вариации показателя (CV): ≤ 10% – слабая вариабельность; при 10% … 20% – средняя; более 20% – высокая. Для оценки уровня значимости показателя применяли t-критерий Стьюдента (Student's t-tests, T) при Р ≤ 0,05. [4]

Результаты статистически обрабатывали с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2016.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эффективность введения эксплантов в культуру in vitro определяется в большей степени сроками их получения. При изоляции меристем в апреле доля прижившихся эксплантов зависит от генотипических особенностей сорта и метеоусловий в период образования растительного материала. Число жизнеспособных эксплантов сортов среднераннего срока созревания (Газель, Вика) было больше, чем у позднего Валентиновка, что объясняется их более ранним выходом из состояния глубокого покоя (рис. 2).

 

Рис. 2. Показатели жизнеспособности эксплантов смородины красной на этапе инициации культуры in vitro.

 

Показатели приживаемости эксплантов сортов Газель и Вика по годам (43,66 и 67,46%, 57,14 и 50,47% соответственно) не имели достоверных отличий. Для Валентиновки более высокие положительные температуры в марте и плавный ход температур зимой 2023 года определили более ранний выход почек из состояния покоя и, как следствие, лучшую приживаемость меристем (64,29%), чем в 2022 (14,53%) (рис. 1). Дифференциация почек по цветочному типу и небольшие размеры меристем у всех сортов затруднили выделение меристематических верхушек и определили высокий процент погибших эксплантов.

В летний период приживаемость сортов Газель и Вика была ниже, чем весной. Существенного различия между показателями приживаемости меристем по годам (53,33 и 45,95%, 55,83 и 49,14% соответственно) при этом не отмечено. Приживаемость меристем сорта Валентиновка в 2023 году была низкой, в 2022 экспланты полностью погибли (рис. 2). Низкая приживаемость меристем при введении в культуру в июне связана с большой долей отмерших и зараженных побегов, что может быть вызвано более активным развитием сапрофитной микрофлоры в летний период и токсичным воздействием стерилизующего агента на ткани экспланта.

В исследованиях для культивирования полученных из почек меристематических верхушек использовали три варианта питательной среды с разным соотношением фитогормонов. Установлено, что изменение состава питательной среды не оказывало существенного влияния на приживаемость эксплантов на этапе инициации культуры in vitro (табл. 2). Таким образом, экспланты смородины красной неотзывчивы на изменения концентрации гормонов и для их культивирования при введении в культуру подходят все варианты питательной среды.

 

Таблица 2. Показатели жизнеспособности эксплантов смородины красной на этапе инициации культуры

Год	Питательная среда	Показатели жизнеспособности (% общего числа введенных меристем)				Год	Питательная среда	Показатели жизнеспособности (% общего числа введенных меристем)
		заражение	некроз*	доля жизнеспособных эксплантов**				заражение	некроз*	доля жизнеспособных эксплантов**
Апрель						Июнь
Валентиновка						Валентиновка
2022	MS (контроль)	5,41	78,38	16,22		2022	MS (контроль)	20,00	80,00	0
	MS1	17,50	55,00	27,50			MS1	30,00	70,00	0
	MS2	12,50	87,50	0			MS2	18,00	82,00	0
Газель						Газель
	MS (контроль)	30,43	69,57	0			MS (контроль)	0	45,00	55,00
	MS1	20,00	22,50	57,50			MS1	0	45,00	55,00
	MS2	20,00	25,00	55,00			MS2	2,50	47,50	50,00
Вика						Вика
	MS (контроль)	27,78	43,48	69,57			MS (контроль)	0	57,50	42,50
	MS1	—***	—	—			MS1	5,00	45,00	50,00
	MS2	14,71	12,50	60,00			MS2	0	25,00	75,00
Валентиновка						Валентиновка
2023	MS (контроль)	10,87	26,09	63,04		2023	MS (контроль)	9,68	54,84	35,48
	MS1	2,50	32,50	65,00			MS1	15,00	85,00	0
	MS2	5,00	30,00	65,00			MS2	12,50	50,00	37,50
Газель						Газель
	MS (контроль)	2,17	23,91	73,91			MS (контроль)	0	54,84	45,16
	MS1	5,00	32,50	62,50			MS1	2,50	55,00	42,50
	MS2	5,00	30,00	65,00			MS2	2,50	47,50	50,00
Вика						Вика
	MS (контроль)	3,70	26,09	30,43			MS (контроль)	0,00	74,19	48,39
	MS1	5,00	30,00	65,00			MS1	5,26	40,00	50,00
	MS2	2,50	62,50	35,00			MS2	0	45,00	55,00
CV, %	Валентиновка	7,46	12,22	14,31		CV, %	Валентиновка	19,42	5,21	71,81
	Газель	3,50	17,47	8,96			Газель	81,65	2,15	1,62
	Вика	51,97	12,25	13,67			Вика	141,42	21,63	18,73
T (для показателя 1)		TMSконтр.–MS1 = 1,1		TMSконтр.–MS2 = 0,1	TMS1–MS2 = 0,8	T (для показателя 1)		T MSконтр.–MS1 = 0,2		TMSконтр.– MS2 = 0,5	TMS1–MS2 = 0,8
T (для показателя 2)		TMSконтр.–MS1 = 1,8		TMSконтр.–MS2 = 0,9	TMS1–MS2 = 0,2	T (для показателя 2)		TMSконтр –MS1 = 0,1		TMSконтр.–MS2 = 0,5	TMS1–MS2 = 0,5

Примечание. * Показатель 1, ** Показатель 2, *** – нет данных.

 

На этапе пролиферации было два варианта питательных сред (MS₃, MS₄). Объект изучения – сорта Газель и Вика. В связи с гибелью большей части эксплантов сорта Валентиновка его исключили из опыта.

Отметили влияние генотипа на параметры развития эксплантов. Изменение гормонального состава питательной среды не оказало существенного влияния на пролиферативную активность эксплантов сорта Вика. Введение в питательную среду комплекса гормонов разной направленности действия и снижение концентрации цитокинина привело к снижению коэффициента размножения эксплантов сорта Газель, вместе с тем доля микрорастений высотой менее 5 мм снизилась почти в два раза. Количество микропобегов, образующих дополнительные почки, уменьшилось в три раза, по сравнению со средой MS₃ (табл. 3).

 

Таблица 3. Результаты культивирования микропобегов сортов смородины красной на питательных средах с различным гормональным составом

Сорт	Коэффициент размножения		Число, %
			пролиферирующих эксплантов		микропобегов менее 5 мм
	MS3	MS4	MS3	MS4	MS3	MS4
Газель	2,0 ± 0,1	1,5 ± 0,1	90,0	27,2	88,0	42,8
Вика	1,4 ± 0,1	1,4 ± 0,1	31,0	25,4	77,8	76,4
НСР05	1,17 Fф < F0,5	0,18 Fф < F0,5	1,62 Fф > F0,5	8,04 Fф < F0,5	7,9 Fф > F0,5	10,2 Fф > F0,5

 

Выводы. Из исследуемых факторов культивирования при введении в культуру in vitro смородины красной наиболее сильное воздействие оказывают сроки изоляции эксплантов и соответствующие им климатические условия, а также генотипические особенности сортов. Благоприятный период для изоляции меристем смородины красной – весна (апрель). Изменение состава питательной среды, в частности, концентрации витаминов, не сильно повлияло на приживаемость эксплантов на этапе введения в культуру in vitro. При микроразмножении проявлялась сортоспецифичная реакция на внесение в состав питательной среды цитокининов, ауксинов и гибберелловой кислоты в низких концентрациях.

Об авторах

Нелли Васильевна Ряго

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур

Автор, ответственный за переписку.
Email: ryago@orel.vniispk.ru

аспирант

Россия, д. Жилина, Орловская обл.

Татьяна Михайловна Хромова

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур

Email: ryago@orel.vniispk.ru

кандидат биологических наук

Россия, д. Жилина, Орловская обл.

Лариса Владимировна Ташматова

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур

Email: ryago@orel.vniispk.ru

кандидат сельскохозяйственных наук

Россия, д. Жилина, Орловская обл.

Список литературы

Дополнительные файлы