Modification of emulsified fat (nanofat) obtaining procedures

Full Text

Введение

Методика получения эмульгированного жира, «наножира» (nanofat), была впервые описана P. Tonnard et al. в 2013 г. Этот метод используется для подготовки жировой ткани к аутотрансплантации. Жировую ткань получают из подкожной жировой клетчатки методом липоаспирации (липосакции), затем специальным образом фильтруют через специальные анаэробные клеточные трансферы с постепенно уменьшающимся диаметром, а затем эмульгируют через специальную сетку. Полученный продукт, «наножир» (nanofat), по данным авторов, содержит минимальное количество жизнеспособных адипоцитов и большое количество колониеобразующих стромальных клеток с мультидифференцированным потенциалом [1]. Ввиду высокого содержания клеток регенераторного ряда, эмульгированный жир используется с косметической целью для коррекции рубцов, морщин, дефектов кожи [2], а также с лечебной целью для закрытия небольших дефектов мягких тканей в тех случаях, когда наряду с волюмизирующим требуется регенераторный эффект, например, для заполнения свищей, последствий лучевых поражений и других дефектов мягких тканей [3].

Большинство протоколов, включая оригинальную методику P. Tonnard et al., описывают поочередную фильтрацию жира через каждый анаэробный клеточный фильтр 30 пассажами, то есть движениями поршня шприца, в результате которого липоаспират перемещается из одного шприца в другой через каждый фильтр, с постепенным уменьшением диаметра отверстий переходников [1]. На практике процесс поочередной фильтрации жира длительный, предполагает использование нескольких фильтров перед применением непосредственно эмульгирующей сетки, к тому же, с каждым пассажем возрастает вероятность травматизации клеток.

Цель исследования – оптимизировать алгоритм получения жировой эмульсии, определив возможности модификации методики P. Tonnard et al. (2013) путем исключения из процесса фильтрации липографта одного из фильтров и уменьшения количества пассажей через оставшиеся два.

Материалы и методы исследования

Исследование включало 16 образцов жира, аспирированных шприцевым способом с абдоминальной области под местной инфильтрационной анестезией раствором Кляйна. Применялись вакуумная и шприцевая методики липоаспирации канюлями диаметром 4 и 2,4 мм соответственно. Липоаспират собирался в анаэробных условиях и в течение 2–3 ч доставлялся в лабораторию. Для фильтрации жира применялись анаэробные клеточные трансферы с внутренним диаметром 1,4 и 1,2 мм, а также эмульсифицирующий фильтр, содержащий сетку с многочисленными ячейками с внутренним диаметром 0,5 мм («нанофильтр»). Подготовка липоаспирата к фильтрации через эмульсифицирующий фильтр включала фильтрацию через анаэробный клеточный трансфер с одним отверстием диаметром 1,4 мм либо 1,2 мм. Для определения оптимального, необходимого и достаточного режимов фильтрации исследование включало следующие протоколы: 10 либо 30 пассажей через один фильтр с одним отверстием, затем 5, 10, 20 либо 30 пассажей через эмульгирующий «нанофильтр». Фильтрация производилась до момента получения гомогенной жировой ткани. Итогом фильтрации в обоих случаях стала визуально идентичная однородная эмульгированная жировая эмульсия.

Анализ волюмизирующего потенциала липографта включал оценку количества и морфологических характеристик адипоцитов, для определения его регенераторного потенциала оценивали характеристики фибробластоподобных клеток (ФПК), то есть клеток, имеющих фенотип фибробласта. Среди последних выделяют три разновидности: крупные распластанные клетки с крупным ядром; клетки, напоминающие фибробласты и считающиеся наиболее зрелыми; клетки веретеновидной и округлой формы, которые рассматриваются как более молодые мезенхимальные стромальные клетки [4]. Также качественно оценивались характер распределения соединительной ткани в образцах и соединительнотканные перемычки между адипоцитами.

Мазки готовили из липоаспирата, нанося последний тонким слоем на предметное стекло, фиксировали их ацетоном с последующим окрашиванием по Май – Грюнвальду. Подсчет клеток производился при помощи микроскопа «Микмед-1». В каждом мазке осуществляли подсчет морфологически неповрежденных и разрушенных адипоцитов и фибробластоподобных клеток (ФПК), оценивали их процентное содержание. Для удобства подсчет в каждом мазке вели из расчета на 100 клеток.

Анализ полученных данных производился с помощью программы Microsoft Excel, использованы методы описательной статистики, в том числе средние величины и частоты данных.

Результаты и их обсуждение

По полученным ранее данным [5], при поочередной фильтрации жира с помощью фильтров 1,4 мм (30 раз), 1,2 мм (30 раз), затем «нанофильтра» (30 раз) в мазках практически отсутствовали соединительнотканные перемычки и остатки соединительной ткани. Адипоциты в большинстве случаев после длительной фильтрации теряли свою форму, имели морфологические признаки деструкции, в мазках определялся гомогенный жир. Содержание неповрежденных адипоцитов составляло в итоге, по полученным ранее данным, в зависимости от количества пассажей, 4–16 %, фибробластоподобных клеток – 6–16 %, с постепенным уменьшением их числа после каждых 10 пассажей. Применение эмульсифицирующего («нано») фильтра привело к разрушению 56–78 % адипоцитов и 12–14 % фибробластоподобных клеток. При использовании фильтра с внутренним диаметром 1,4 мм, а затем сразу «нанофильтра», минуя фильтр диаметром 1,2 мм, получены следующие результаты (табл. 1).

 

Таблица 1. Морфологические характеристики адипоцитов и фибробластоподобных клеток при использовании различного числа пассажей через 1,4-миллиметровый фильтр и «нанофильтр»

Критерий	1,4 мм – 10 пассажей, далее «нанофильтр» – 5 пассажей	1,4 мм – 10 пассажей, далее «нанофильтр» – 10 пассажей	1,4 мм – 30 пассажей, далее «нанофильтр» – 10 пассажей
Морфологически неповрежденные адипоциты, %	40	28	20
Морфологически разрушеные адипоциты, %	24	40	50
Морфологически неповрежденные фибробластоподобные клетки, %	24	20	16
Морфологически разрушенные фибробластоподобные клетки, %	12	12	14

 

В мазках заметно присутствие соединительной ткани в виде перемычек между комплексами оставшихся неповрежденными адипоцитов с морфологически неповрежденными фибробластоподобными клетками, располагающимися в соединительнотканных волокнах и находящимися в их структуре. Часть адипоцитов сохранила свою форму, однако большую часть занимал гомогенный жир (рис. 1).

 

Рис. 1. Морфологическая структура липографта: а – после фильтрации через 1,4 мм трансфер – 10 раз, «нанофильтр» 0,5 мм – 20 раз. Конгломерат адипоцитов с остатками соединительной ткани, в которой располагается большое количество морфологически целых фибробластоподобных клеток; б – после фильтрации через фильтр 1,4 мм – 30 раз, затем «нанофильтр» – 30 раз. Тонкие прослойки соединительной ткани с фибробластоподобными клетками

 

Если количество пассажей через фильтр 1,4 мм увеличить до 30 раз, а затем провести фильтрацию жира через «нанофильтр» 10 раз, то число морфологически целых адипоцитов составляет 20 %, однако морфологически целые фибробластоподобные клетки сохраняются в большом количестве – 18 %.

Таким образом, фильтрация через 1,4-миллиметровый фильтр, а далее через «нанофильтр» ведет к сохранению многочисленных остатков соединительной ткани в «наножире», содержащей в своей структуре фибробластоподобные клетки. Данный эффект сохранения прослоек соединительной ткани, содержащей ФПК от 16 до 24 %, в структуре липографта требует дальнейшего изучения, определения возможностей его эффективного применения с регенераторной целью.

В то же время необходимо отметить, что при фильтрации через фильтр 1,4 мм получен еще один вид жировой эмульсии: однородная эмульгированная жировая ткань, которую можно вводить шприцом с тонкой иглой, но при этом с высоким содержанием морфологически целых адипоцитов. Для данного протокола предпочтительно использовать фильтрацию с помощью анаэробного клеточного трансфера с внутренним диаметром 1,4 мм 10 раз, затем – «нанофильтром» 5 раз.

При фильтрации жира изначально через фильтр 1,2 мм, а далее через эмульсифицирующий («нано») фильтр значимо снижается количество морфологически целых адипоцитов (табл. 2).

 

Таблица 2. Морфологические характеристики адипоцитов и фибробластоподобных клеток при использовании различного числа пассажей через фильтр 1,2 мм и «нанофильтр»

Критерий	1,2 мм – 10 пассажей, далее «нанофильтр» – 10 пассажей	1,2 мм – 10 пассажей, далее «нанофильтр» – 20 пассажей	1,2 мм – 10 пассажей, далее «нанофильтр» – 30 пассажей	1,2 мм – 30 пассажей, далее «нанофильтр» – 10 пассажей	1,2 мм – 30 пассажей, далее «нанофильтр» – 20 пассажей	1,2 мм – 30 пассажей, далее «нанофильтр» – 30 пассажей
Морфологически целые адипоциты, %	28	8	4	20	8	0
Морфологически разрушеные адипоциты, %	40	56	68	44	66	76
Морфологически целые фибробластоподобные клетки, %	20	16	10	28	10	8
Морфологически разрушенные фибробластоподобные клетки, %	12	20	18	8	16	16

 

Почти в 100 % случаев определяются признаки разрушения адипоцитов, лежащих поодиночке. При возрастании количества пассажей через «нанофильтр» отмечается увеличение число разрушенных фибробластоподобных клеток (рис. 2, а). Оставшиеся неповрежденными единичные адипоциты лежат в основном в виде небольших конгломератов, вокруг которых определяются слабо выраженные прослойки соединительной ткани, которые могут сохранятся и при фильтрации через фильтр 1,2 мм – 30 раз, «нанофильтра» – 30 раз (рис. 2, б).

 

Рис. 2. Морфологическая структура липографта после фильтрации: а – через фильтр 1,2 мм – 10 раз, затем «нанофильтр» – 10 раз. Разрушенные адипоциты, лежащие поодиночке; б – через фильтр 1,2 мм – 30 раз, затем «нанофильтр» – 30 раз. Гомогенный жир. Сохранены тонкие перемычки соединительной ткани

 

Таким образом, оптимальным по соотношению клеточного состава алгоритмом было проведение фильтрации липографта через 1,2-миллиметровый фильтр с помощью 10 пассажей, за счет чего сохраняется жизнеспособным оптимальное число фибробластоподобных клеток, а затем при помощи «нанофильтра» 20 пассажами, за счет чего разрушаются «ненужные» адипоциты, соблюдается оптимальный баланс минимального количества адипоцитов при сохранении фибробластоподобных клеток.

В эмульгированном «наножире» содержание жизнеспособных адипоцитов минимально, что подтверждается результатами текущего исследования и данными литературы [1]. В то же время жировая эмульсия содержит достаточное количество жизнеспособных клеток регенераторного ряда, в том числе фибробластоподобных клеток, по данным этой работы, а также мезенхимальных стромальных клеток, клеток стромально-васкулярной фракции и факторов роста – по данным литературы [1]. Исходя из указанного соотношения адипоцитов и клеток регенераторного ряда, применение жировой эмульсии («наножира») нецелесообразно для заполнения больших объемов мягких тканей. Использование его показано в тех случаях, когда основным ожидаемым эффектом от аутотрансплантации служит регенераторный: для коррекции рубцов и заполнения небольших дефектов мягких тканей с исходно низком регенераторным потенциалом, а также с эстетической целью [3].

По данным P. Tonnard et al. (2013), количество жизнеспособных стволовых клеток варьировалось от 1,9 до 3,0 (10⁶) на 100 мл липоаспирата, независимо от метода обработки жировой ткани и при переходе от фильтра к фильтру [1]. В работе В.С. Васильева и соавт. [6] выявлены схожие данные: в гистологических мазках, полученных при использовании фильтра 1,2 мм и «нанофильтра», содержались клеточные конгломераты диаметром менее 0,5 мм, которые характеризовались уменьшением соотношения целых адипоцитов к остальным клеткам и разрушением тканевой структуры в процессе фильтрации. Однако для получения «наножира» авторы использовали 50-кратные пассажи жира, предварительно обработанного через фильтры 1,4 и 1,2 мм [6].

Osinga et al. (2015) продемонстрировали отсутствие влияния числа пассажей в рамках фильтрации через один анаэробный клеточный трансфер на число клеток стромально-васкулярной фракциии [7].

В исследовании X. Chen et al. (2020) сравнивали три протокола получения эмульгированного жира, в результате отмечено, что меньший диаметр фильтра создает более высокую механическую силу сдвига, которая разрушает большее количество жировых клеток во время процедуры эмульгирования, тем самым снижая жизнеспособность стволовых клеток из стромально-васкулярной фракции. «Наножир», полученный из 2-миллиметрового анаэробного клеточного трансфера, имел лучший эффект на омоложение кожи, чем 1,5-миллиметровые и 1,1-миллиметровые коннекторы [8].

Данные, полученные в текущей работе, подтверждают результаты исследований о том, что увеличение числа пассажей внутри одного анаэробного клеточного трансфера приводит к усилению травматизации адипоцитов и фибробластоподобных клеток. Также разработаны протоколы получения однородной жировой эмульсии с различными вариантами клеточного состава, включающие использование одного анаэробного клеточного трансфера перед применением эмульгирующего «нанофильтра» и уменьшения числа пассажей через каждый из них.

Выводы

1. Для получения «наножира» возможна оптимизация протокола фильтрации липографта с использованием одного анаэробного клеточного трансфера с внутренним диаметром 1,2 мм с помощью 10 пассажей, за счет чего сохраняется необходимое соотношение минимального числа адипоцитов при сохранении фибробластоподобных клеток.
2. Фильтрация через анаэробный клеточный трансфер с внутренним диаметром 1,4 мм, а далее через «нанофильтр» ведет к сохранению многочисленных остатков соединительной ткани, содержащей фибробластоподобные клетки, что требует дальнейшего изучения с целью определения возможностей его эффективного применения с регенераторной целью.
3. В то же время получен еще один вид липографта, однородная эмульгированная жировая ткань с высоким содержанием морфологически интактных адипоцитов, диаметр частиц которой позволяет вводить ее шприцом с тонкой иглой. Для этого производят фильтрацию жировой ткани с помощью анаэробного клеточного трансфера с внутренним диаметром 1,4 мм 10 раз, затем – с помощью «нанофильтра» 5 раз.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

N. I. Khramtsova

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: renelve@gmail.com

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Public Health and Healthcare № 1

Russian Federation, Perm

S. A. Plaksin

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: splaksin@mail.ru

MD, PhD, Professor, Department of Surgery with Course of Cardiovascular Surgery and Invasive Cardiology

Russian Federation, Perm

N. I. Gulyaeva

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: bizon55@mail.ru

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Histology, Embryology and Cytology

Russian Federation, Perm

A. Yu. Sotskov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: Sozkov1998a@mail.ru

sixth year student

Russian Federation, Perm

D. N. Ponomarev

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: danilpon07@gmail.com

sixth year student

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files