Influence of polymorphism of the gene GCLC on antioxidant defense status in healthy children of Omsk region

E. B. Pavlinova; Павлинова Елена Борисовна; I. A. Kirshina; Киршина Ирина Алексеевна; E. I. Kurmasheva; Курмашева Екатерина Игоревна; N. Yu. Vlasenko; Власенко Наталья Юрьевна; A. G. Mingairova; Мингаирова Александра Геннадьевна; O. A. Savchenko; Савченко Ольга Анатольевна; A. V. Indutnyi; Индутный Антон Васильевич; D. G. Novikov; Новиков Дмитрий Георгиевич

doi:10.17816/pmj36433-38

Influence of polymorphism of the gene GCLC on antioxidant defense status in healthy children of Omsk region

Authors: Pavlinova E.B.¹, Kirshina I.A.¹, Kurmasheva E.I.¹, Vlasenko N.Y.¹, Mingairova A.G.¹, Savchenko O.A.¹, Indutnyi A.V.², Novikov D.G.³
Affiliations:
1. Omsk State Medical University
2. Академический центр лабораторной диагностики Омского государственного медицинского университета
3. Центральная научноHисследовательская лаборатория Омского государственного медицинского университета
Issue: Vol 36, No 4 (2019)
Pages: 33-38
Section: Methods of diagnosis and technologies
URL: https://permmedjournal.ru/PMJ/article/view/16486
DOI: https://doi.org/10.17816/pmj36433-38
ID: 16486

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. To study the status of antioxidant defense in healthy children, living in Omsk Region, depending on polymorphism of the gene GCLC.

Materials and methods. There were examined 50 healthy children aged 3 to 17 years, including 54 % of boys. Polymorphism of the gene GCLC 129С/C, 129C/Т, 129T/T and reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione concentrations were determined. Statistical analysis was implemented using the programs «Statistica 6.0 and DoctorStat1.9.

Results. Polymorphism of the gene GCLC was represented by the genotypes 129C/C (43 children, 86 %) and 129C/T (7 children, 14 %); GSH concentration was within 6.0 [4.4; 7.0] mcmol/l, GSSG concentration – 3.0 [2.3; 3.5] mcmol/l, GSH:GSSG ratio was 2:1. Weak direct correlation between the child age and GSH (r = 0.31; р = 0.028) and GSSG (r = 0.31; р = 0.031) content was established; no gender differences were revealed. Among the subjects with the genotype 129C/T, the blood plasma GSH (р = 0.017) and GSSG (р = 0.016) concentrations decreased by 30 %.

Conclusions. Glutathione concentration in children depends on polymorphism of the gene GCLC.

Keywords

Children, glutathione, gene polymorphism

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Глутатион является одним из основных антиоксидантов, обеспечивающих защиту организма от свободных радикалов. Нейтрализуя активные формы кислорода, две молекулы восстановленного глутатиона (GSH) отдают по одному электрону каждая и превращаются в окисленный глутатион (GSSG) [7].

Значительная часть работ, освещающих особенности гомеостаза глутатиона у здоровых лиц, выполнена более 20 лет назад на взрослых добровольцах, единичные публикации затрагивают данную проблему у детей [8, 9, 14]. Установлено, что концентрация GSH в органах и тканях существенно варьируется, в плазме крови она находится в пределах 2–20 мкмоль/л [10]. Содержание GSSG поддерживается на существенно более низких значениях [7].

Соотношение GSH:GSSG рассматривается как первичный маркер оксидативного стресса: его повышение до 3–4 порядков свидетельствует о снижении антиоксидантного потенциала организма и повышении риска окислительного повреждения клетки [2, 13], что может служить предрасполагающим фактором к развитию ряда заболеваний. Описан дисбаланс уровня глутатиона у лиц с болезнью Паркинсона, злокачественными новообразованиями, патологией легких, печени, а также при старении [15].

Ведущим ферментом, регулирующим скорость образования и концентрацию глутатиона в организме, является глутатионцистеинлигаза [12, 13, 16]. Она состоит из каталитической (GCLC) и регуляторной (GCLM) субъединиц. Имеются немногочисленные данные о зависимости продукции глутатиона от экспрессии гена GCLC [12].

В связи с совершенствованием подходов к персонифицированной терапии актуальной задачей является идентификация генотипов однонуклеотидных полиморфных маркеров у здоровых лиц и при различных заболеваниях [1, 3, 4, 6]. Частота встречаемости полиморфизма GCLC у детей требует дальнейшего изучения.

Цель исследования – изучить состояние антиоксидантной защиты у здоровых детей, проживающих в Омской области, в зависимости от полиморфизма гена GCLC.

Задачи исследования:

– определить частоту встречаемости полиморфизма гена GCLC у здоровых детей с учетом их возраста и пола;

– установить особенности изменения концентрации GSH и GSSG и их отношения у здоровых детей с учетом возраста и пола;

– выявить изменения концентрации GSH и GSSG в зависимости от полиморфизма гена GCLC.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выполнено одномоментное исследование методом поперечного среза.

Критерии включения: возраст от 3 до 17 лет, наличие информированного согласия родителей. Критерии исключения: наличие острых заболеваний, хроническая соматическая патология. Минимальное количество наблюдений определено с помощью номограммы Альтмана.

Забор крови у детей проводился утром натощак путем пункции локтевой вены.

Концентрация GSH и GSSG в плазме крови определялась с помощью диагностического набора Glutathione Assay Kit (Cayman Chemical Company, США) на планшетном фотометре iMark (BIORAD, США). Количественная оценка GSH проводилась методом ферментативной рециркуляции с использованием глутатионредуктазы, концентрация GSSG определялась согласно альтернативному протоколу. Итоговые значения молярности GSH и GSSG рассчитывались с помощью компьютерной программы.

Материал для проведения генетического анализа был получен из лейкоцитов венозной крови с использованием комплекса реагентов «SNP-экспресс» («Литех», Россия). Посредством полимеразной цепной реакции в термоциклире Gradient Palm Cycler (Corbett Life Science, Австралия) определялся полиморфизм гена GCLC: 129С/C, 129C/Т и 129T/T. Детекция результатов проводилась путем электрофореза в 3%-ном агарозном геле на приборе BioVision (Vilber Loumat, Франция).

Обработка данных выполнялась в лицензионном программном обеспечении Statistica 6.0 и свободном программном обеспечении DoctorStat 1.9. Оценка соответствия распределения признаков нормальному проводилась посредством критерия Шапиро – Уилка. При распределении количественных признаков, отличных от нормального, данные обрабатывались с помощью критерия Манна – Уитни для двух независимых переменных и критерия Краскела – Уоллиса для трех независимых переменных; результаты представлялись в виде Me [QL; QU], где Ме – медиана, QL – нижний квартиль, QU – верхний квартиль. Корреляция Спирмена применялась для изучения взаимосвязей. Анализ качественных признаков проводился посредством критерия Фишера. Критический уровень значимости в данном исследовании принимался равным 0,05.

Работа одобрена этическим комитетом Омского государственного медицинского университета (протокол № 105 от 14.06.2018 г.). Информированное согласие родителей на участие в исследовании получено.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Обследовано 50 здоровых детей, из них 27 (54 %) мальчиков и 23 (46 %) девочки. Распределение по возрасту отражало преобладание пациентов младше 6 лет (Шапиро – Уилка, p = 0,00001), в связи с этим были сформированы три подгруппы. В 1-ю подгруппу вошло 26 человек в возрасте 4 лет [3, 0; 5, 0], во 2 подгруппу – 11 детей в возрасте 8 лет [8, 0; 11, 0], 3 подгруппу составили 13 подростков в возрасте 15 лет [15, 0; 17, 0]. Подгруппы были сопоставимы между собой по гендерному признаку (Фишера, p = 0,090).

Идентификация генотипов однонуклеотидных полиморфных маркеров показала, что среди обследованных детей доминировал GCLC 129C/C – 43 (86 %) ребенка; в 7 (14 %) случаях диагностирован генотип 129C/T и ни в одном наблюдении не было зафиксировано носительства 129T/Т. Не установлено значимых гендерных (Фишера, р = 0,225) и возрастных (Фишера, р = 0,198) особенностей частоты встречаемости генотипа 129C/T среди обследованных детей.

У наблюдаемых пациентов концентрации GSH (Шапиро – Уилка, p = 0,00003) и GSSG (Шапиро – Уилка, p = 0,00003) не соответствовали нормальному распределению, определяясь в пределах 6,0 [4, 4; 7, 0] и 3,0 [2, 3; 3, 5] мкмоль/л соответственно. Результаты иммуноферментного анализа представлены в табл. 1.

Таблица 1

Концентрация окисленной и восстановленной форм глутатиона у здоровых детей в зависимости от возраста, Me [QL; QU]

Показатель	Подгруппа			Критерий	р
Показатель	1-я (n = 26)	2-я (n = 11)	3-я (n = 13)	Критерий	р
Восстановленный глутатион (GSH), мкмоль/л	5,4 [4, 2; 6, 9]	6,6 [4, 2; 7, 2]	6,5 [5, 3; 9, 2]	Краскела – Уоллиса	0,287
Окисленный глутатион (GSSG), мкмоль/л	2,7 [2, 2; 3, 5]	3,3 [2, 1; 3, 6]	3,26 [2, 7; 4, 6]	Краскела – Уоллиса	0,303
Соотношение GSH:GSSG	2:1	2:1	2:1	Фишера	1,000

Во всех анализируемых случаях соотношение GSH:GSSG было 2:1, что отражало физиологический баланс форм глутатиона в организме. Дополнительно к этому не отмечено значимых различий содержания GSH (Манна – Уитни, р = 0,419) и GSSG (Манна – Уитни, р = 0,397) в плазме крови у мальчиков и девочек.

Отмечены слабые положительные взаимосвязи между возрастом обследованных детей и молярностью GSH (Спирмена, r = 0,31; р = 0,028) и GSSG (Спирмена, r = 0,31; р = 0,031). Анализируя гендерные особенности, стоит отметить тенденцию к повышению концентрации GSH (Спирмена, r = 0,35; р = 0,075) и GSSG (Спирмена, r = 0,32; р = 0,098) у мальчиков по мере взросления.

Учитывая полученные результаты, была оценена концентрация GSH и GSSG в зависимости от полиморфизма GCLC. При носительстве полиморфизма 129C/T содержание GSH и GSSG в плазме крови было на 30 % ниже, чем у детей, имевших генотип 129C/C (Манна – Уитни, р = 0,017 и р = 0,016 соответственно).

Оценка концентрации GSH и GSSG была проведена с учетом данных, полученных от 43 детей с генотипом GCLC 129C/C (табл. 2).

Таблица 2

Перцентильное распределение концентрации окисленной и восстановленной форм глутатиона у здоровых детей с генотипом GCLC 129C/C

Показатель	Перцентиль
Показатель	10-й	25-й	50-й	75-й	90-й
Восстановленный глутатион (GSH), мкмоль/л	4,0	5,0	6,2	7,6	9,2
Окисленный глутатион (GSSG), мкмоль/л	2,0	2,5	3,1	3,8	4,6

Полученные в настоящем исследовании результаты частично описаны в научной литературе. Так, генотип GCLC 129C/C определялся у 83–92 % здоровых лиц [10, 11], в том числе и у детей [5]. Согласно S. Koide et al. [12], при носительстве аллеля Т гена GCLC регистрировалась сниженная на 40–50 % активность промотора, что могло способствовать меньшей продукции глутатиона.

Представлены данные о возрастных и гендерных особенностях содержания глутатиона у взрослых и детей. В исследовании P.S. Samiec et al. [14] установлены более высокие концентрации GSH и GSSG у молодых лиц в сравнении с пациентами старше 60 лет, а E.W. Flagg et al. [9] было отмечено нарастание молярности общего глутатиона у мужчин с возрастом. Работа M. Erden-Inal et al. [8] затрагивала особенности антиоксидантного статуса у детей. У пациентов младше 2 лет содержание GSH определялось в значимо меньших концентрациях, а GSSG – в больших, чем у детей старше 2 лет и подростков. Авторами не установлено гендерных отличий молярности форм глутатиона у детей, однако наблюдалось повышение соотношения GSH:GSSG у мальчиков.

ВЫВОДЫ

Частота встречаемости генотипа GCLC 129C/C у здоровых детей, проживающих в Омской области, составила 86 % и не зависела от их возраста и пола.
Установлено наличие слабых положительных корреляционных связей между возрастом обследованных детей и концентрациями окисленного и восстановленного глутатиона.
У носителей генотипа GCLC 129C/T наблюдалось значимое снижение концентрации окисленного и восстановленного глутатиона.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №18-015-00219 А.

About the authors