Влияние РНК-связывающего белка Sam68 на активность поли(ADP-рибоза)-полимеразы 1

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Принимая во внимание участие РНК-связывающих белков в регуляции активности поли(ADP-рибоза)-полимеразы 1 (PARP1), ключевого фактора репарации ДНК, было проведено исследование влияния внутренне неупорядоченного белка Sam68 на каталитическую активность этого фермента. Для проведения исследования была получена плазмидная конструкция, содержащая в своем составе кодирующую последовательность белка Sam68, проведена оптимизация условий экспрессии Sam68 в клетках Escherichia coli, отработана методика его выделения и подобраны условия для рефолдинга этого белка из телец включения. Наши исследования в реконструированной системе показали, что Sam68 способен регулировать каталитическую активность PARP1, стимулируя ее авто-поли(ADP-рибозил)ирование. Определено сродство Sam68 к поврежденной ДНК и очищенной поли(ADP-рибозе) (PAR). На основании полученных экспериментальных данных была предложена гипотеза, объясняющая механизм стимуляции активности PARP1 белком Sam68. Согласно этой гипотезе, Sam68 взаимодействует с PAR, ковалентно присоединенной к PARP1, экранирует отрицательный заряд PAR и тем самым увеличивает время жизни активного комплекса авто-поли(ADP-рибозил)ированной PARP1 с поврежденной ДНК. Это приводит к возрастанию уровня PAR, синтезируемой этим ферментом.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

К. Н. Науменко

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

Е. А. Бережнев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

Т. А. Кургина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

М. В. Суханова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

О. И. Лаврик

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

Список литературы

  1. Vermeij, W. P., Hoeijmakers, J. H., and Pothof, J. (2016) Genome integrity in aging: human syndromes, mouse models, and therapeutic options, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 56, 427-445, https://doi.org/10.1146/annurev- pharmtox-010814-124316.
  2. Althaus, F. R., Kleczkowska, H. E., Malanga, M., Müntener, C. R., Pleschke, J. M., et al. (1999) Poly ADP-ribosylation: a DNA break signal mechanism. Mol. Cell. Biochem., 193, 5-11, https://doi.org/10.1007/978-1-4419-8740-2_1.
  3. D’Amours, D., Desnoyers, S., D’Silva, I., and Poirier, G. G. (1999) Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions, Biochem. J., 342 (Pt 2), 249-268, https://doi.org/10.1042/bj3420249.
  4. Huang, D., and Kraus, W. L. (2022) The expanding universe of PARP1-mediated molecular and therapeutic mechanisms, Mol. Cell, 82, 2315-2334, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.02.021.
  5. Alemasova, E. E., and Lavrik, O. I. (2019) Poly(ADP-ribosyl)ation by PARP1: reaction mechanism and regulatory proteins, Nucleic Acids Res., 47, 3811-3827, https://doi.org/10.1093/nar/gkz120.
  6. Ayyappan, V., Wat, R., Barber, C., Vivelo, C. A., Gauch, K., Visanpattanasin, P., Cook, G., Sazeides, C., and Leung, A. K. L. (2021) ADPriboDB 2.0: an updated database of ADP-ribosylated proteins, Nucleic Acids Res., 49, D261-D265, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa941.
  7. Corley, M., Burns, M. C., and Yeo, G. W. (2020) How RNA-binding proteins interact with RNA: molecules and mechanisms, Mol. Cell, 78, 9-29, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.03.011.
  8. Altmeyer, M., Neelsen, K. J., Teloni, F., Pozdnyakova, I., Pellegrino, S., Grøfte, M., Rask, M. D., Streicher, W., Jungmichel, S., Nielsen, M. L., and Lukas, J. (2015) Liquid demixing of intrinsically disordered proteins is seeded by poly(ADP-ribose), Nat. Commun., 6, 8088, https://doi.org/10.1038/ncomms9088.
  9. Singatulina, A. S., Hamon, L., Sukhanova, M. V., Desforges, B., Joshi, V., Bouhss, A., Lavrik, O. I., and Pastré, D. (2019) PARP-1 activation directs FUS to DNA damage sites to form PARG-reversible compartments enriched in damaged DNA, Cell Rep., 27, 1809-1821.e5, https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.04.031.
  10. Neelamraju, Y., Hashemikhabir, S., and Janga, S. C. (2015) The human RBPome: from genes and proteins to human disease, J. Proteomics, 127 (Pt A), 61-70, https://doi.org/10.1016/j.jprot.2015.04.031.
  11. Alemasova, E. E., Naumenko, K. N., Pestryakov, P. E., and Lavrik, O. I. (2017) Production, purification of the recombinant analog of Y-box-binding protein 1 and its interaction with poly(ADP-ribose), RNA, single- and double-stranded DNAs, Biopolym. Cell, 33, 214-220, https://doi.org/10.7124/bc.000954.
  12. Alemasova, E. E., Naumenko, K. N., Kurgina, T. A., Anarbaev, R. O., and Lavrik, O. I. (2018) The multifunctional protein YB-1 potentiates PARP1 activity and decreases the efficiency of PARP1 inhibitors, Oncotarget, 9, 23349-23365, https://doi.org/10.18632/oncotarget.25158.
  13. Naumenko, K. N., Sukhanova, M. V., Hamon, L., Kurgina, T. A., Alemasova, E. E., Kutuzov, M. M., Pastré, D., and Lavrik, O. I. (2020) Regulation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity by Y-box-binding protein 1, Biomolecules, 10, 1325, https://doi.org/10.3390/biom10091325.
  14. Naumenko, K. N., Sukhanova, M. V., Hamon, L., Kurgina, T. A., Anarbaev, R. O., Mangerich, A., Pastré, D., and Lavrik, O. I. (2022) The C-terminal domain of Y-box binding protein 1 exhibits structure-specific binding to poly(ADP-ribose), which regulates PARP1 activity, Front. Cell. Dev. Biol., 10, 831741, https://doi.org/10.3389/fcell.2022.831741.
  15. Sun, X., Fu, K., Hodgson, A., Wier, E. M., Wen, M. G., Kamenyeva, O., Xia, X., Koo, L. Y., and Wan, F. (2016) Sam68 is required for DNA damage responses via regulating poly(ADP-ribosyl)ation, PLoS Biol., 14, e1002543, https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002543.
  16. Gagné, J. P., Pic, E., Isabelle, M., Krietsch, J., Ethier, C., Paquet, E., Kelly, I., Boutin, M., Moon, K. M., Foster, L. J., and Poirier, G. G. (2012) Quantitative proteomics profiling of the poly(ADP-ribose)-related response to genotoxic stress, Nucleic Acids Res., 40, 7788-7805, https://doi.org/10.1093/nar/gks486.
  17. Studier, F. W. (2005) Protein production by auto-induction in high density shaking cultures, Protein expr. purif., 41, 207-234, https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.01.016.
  18. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.
  19. Kurgina, T. A., Anarbaev, R. O., Sukhanova, M. V., and Lavrik, O. I. (2018) A rapid fluorescent method for the real-time measurement of poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity, Anal. Biochem., 545, 91-97, https:// doi.org/10.1016/j.ab.2017.12.033.
  20. Costa, S., Almeida, A., Castro, A., and Domingues, L. (2014) Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system, Front. Microbiol., 5, 63, https:// doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063.
  21. Lukong, K. E., and Richard, S. (2003) Sam68, the KH domain-containing superSTAR. Biochim. Biophys. Acta, 1653, 73-86, https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2003.09.001.
  22. Duan, Y., Du, A., Gu, J., Duan, G., Wang, C., Gui, X., Ma, Z., Qian, B., Deng, X., Zhang, K., Sun, L., Tian, K., Zhang, Y., Jiang, H., Liu, C., and Fang, Y. (2019) PARylation regulates stress granule dynamics, phase separation, and neurotoxicity of disease-related RNA-binding proteins, Cell Res., 29, 233-247, https://doi.org/10.1038/s41422-019-0141-z.
  23. Churion, K. A., and Bondos, S. E. (2012) Identifying solubility-promoting buffers for intrinsically disordered proteins prior to purification, Methods Mol. Biol., 896, 415-427, https://doi.org/10.1007/978-1-4614-3704-8_28.
  24. Shukla, D., and Trout, B. L. (2010) Interaction of arginine with proteins and the mechanism by which it inhibits aggregation, J. Phys. Chem. B, 114, 13426-13438, https://doi.org/10.1021/jp108399g.
  25. Sarma, R., and Paul, S. (2013) Exploring the molecular mechanism of trimethylamine-N-oxide’s ability to counteract the protein denaturing effects of urea, J. Phys. Chem. B, 117, 5691-5704, https://doi.org/10.1021/jp401750v.
  26. Mamontova, E. M., Clément, M. J., Sukhanova, M. V., Joshi, V., Bouhss, A., Rengifo-Gonzalez, J. C., Desforges, B., Hamon, L., Lavrik, O. I., and Pastré, D. (2023) FUS RRM regulates poly(ADP-ribose) levels after transcriptional arrest and PARP-1 activation on DNA damage, Cell Rep., 42, 113199, https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113199.
  27. Arakawa, J., Uegaki, M., and Ishimizu, T. (2011) Effects of L-arginine on solubilization and purification of plant membrane proteins, Protein Expr. Purif., 80, 91-96, https://doi.org/10.1016/j.pep.2011.05.014.
  28. Teloni, F., and Altmeyer, M. (2016) Readers of poly(ADP-ribose): designed to be fit for purpose, Nucleic Acids Res., 44, 993-1006, https://doi.org/10.1093/nar/gkv1383.
  29. Lin, Q., Taylor, S. J., and Shalloway, D. (1997) Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains, J. Biol. Chem., 272, 27274-27280, https://doi.org/10.1074/jbc.272.43.27274.
  30. Gibson, T. J., Thompson, J. D., and Heringa, J. (1993) The KH domain occurs in a diverse set of RNA-binding proteins that include the antiterminator NusA and is probably involved in binding to nucleic acid, FEBS Lett., 324, 361-366, https://doi.org/10.1016/0014-5793(93)80152-k.
  31. Chen, T., Damaj, B. B., Herrera, C., Lasko, P., and Richard, S. (1997) Self-association of the single-KH-domain family members Sam68, GRP33, GLD-1, and Qk1: role of the KH domain, Mol. Cell. Biol., 17, 5707-5718, https://doi.org/10.1128/MCB.17.10.5707.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Анализ экспрессии His-tag-Sam68 в лизате различных штаммов-продуцентов методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250 (а) или методом вестерн-блота (б). Дорожки: 1 и 14 – маркер молекулярных масс («Bio-Rad», США); 2 и 3 – штамм BL21(DE3) до и после индукции; 4 и 5 – штамм BL21(DE3)GeneX до и после индукции; 6 и 7 – штамм BL21(DE3)pLysS до и после индукции; 8 и 9 – штамм Rosetta(DE3) до и после индукции; 10 и 11 – штамм Rosetta(DE3)pLysS до и после индукции; 12 и 13 – штамм Rosetta(DE3)GamiB до и после индукции

Скачать (241KB)
Метаданные
3. Рис. 2. При экспрессии в клетках E. coli Sam68 накапливается в виде телец включения. а – Анализ содержания His-tag-Sam68 в растворимой и нерастворимой фракциях методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Дорожки: 1 и 8 – маркер молекулярных масс («Bio-Rad»); 2 – растворимая фракция после центрифугирования лизированных клеток; 3 – лизат штамма продуцента Rosetta(DE3)pLysS; 4 – растворимая фракция в 1 М мочевине после центрифугирования лизированных клеток; 5 – нерастворимая фракция; 6 – растворимая фракция в 8 М мочевине; 7 – нерастворимая фракция после обработки лизата клеток 8 М мочевиной. б – Анализ содержания белка после хроматографии на колонке с Ni-NTA. Дорожки: 1 – маркер молекулярных масс; 2 – 0,1 мкг; 3 – 0,2 мкг; 4 – 0,3 мкг; 5 – 0,4 мкг; 6 – 0,5 мкг; 7 – 1 мкг белка, полученные после элюции с Ni-NTA

Скачать (177KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Анализ растворимости Sam68 в мочевине методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 200 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мкМ Sam68 и мочевину в соответствующей концентрации (125 мМ–8 М)

Скачать (71KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Анализ растворимости Sam68 при низкой концентрации мочевины (150 мМ) в присутствии аргинина (а) или TMAO (б) методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Реакционная смесь содержала 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 1 мМ ДТТ, 150 мМ мочевины, 1 мкМ Sam68 и аргинин/ТМАО в указанной концентрации. Анализировали растворимую фракцию (↑) и осадок (↓)

Скачать (182KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Влияние мочевины (а и б) и аргинина (в и г) на каталитическую активность PARP1. а – Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования в присутствии мочевины. б – Диаграмма, построенная после анализа распределения радиоактивности в геле, представленном на панели (а). Активность PARP1 при отсутствии мочевины принята за 100%. в – Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования в присутствии аргинина. г – Диаграмма, построенная после анализа распределения радиоактивности в геле, представленном на панели (в). Активность PARP1 при отсутствии аргинина принята за 100%

Скачать (371KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Sam68 стимулирует активность PARP1. а – Кинетика уровня синтеза PAR в присутствии различных концентраций Sam68. Pеакцию синтеза PAR проводили с использованием [32P]NAD+ и останавливали перенесением аликвот реакционной смеси на бумажный фильтр Whatman, пропитанный ТХУ. На графиках приведены средние значения ± стандартные отклонения для трех независимых экспериментов. б – Анализ авто-PAR-илирования PARP1 и транс-PAR-илирования Sam68 методом денатурирующего гель-электрофореза. Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования белков

Скачать (284KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Связывание PAR белком Sam68. а – Радиоавтограф нативного 5%-ного ПААГ, в котором проводилось разделение комплексов Sam68•PAR. б – Относительный уровень связывания Sam68 с PAR, оцененный по данным анализа электрофореграммы, представленной на панели (а). Сродство (EC50) Sam68 к PAR определяли как концентрацию Sam68, при которой 50% PAR находится в комплексе. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 500 мМ мочевины, 100 мкг/мл БСА, 10 нМ [32P]-меченой PAR и Sam68 в указанных концентрациях (75 нМ–5 мкМ)

Скачать (194KB)
Метаданные
9. Рис. 8. Сродство Sam68 к поврежденной ДНК. Изменение анизотропии флуоресценции ДНК (FAМ-Nick) в присутствии различных концентраций Sam68. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, 500 мМ мочевины, 10 нМ ДНК (FAM-Nick) и Sam68 в указанных концентрациях

Скачать (147KB)
Метаданные
10. Рис. 9. Исследование комплексообразования PARP1 и Sam68 с ДНК (FAM-Nick) методом анизотропии флуоресценции. Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 500 мМ мочевины, 10 нМ ДНК (FAM-Nick), 0–10 мкМ Sam68 и 100 нМ PARP1

Скачать (145KB)
Метаданные
11. Рис. 10. Гипотетический механизм регуляции активности PARP1 белком Sam68. а – Образование комплекса PARP1 с поврежденной ДНК. б – Авто-поли(ADP-рибозил)ирование PARP1. в – Образование комплекса Sam68 с PAR, ковалентно присоединенной к PARP1. Связываясь с PAR, ковалентно присоединенной к PARP1, Sam68 экранирует отрицательный заряд этого полимера, стабилизируя комплекс PARP1 с поврежденной ДНК, и тем самым стимулирует синтез поли(ADP-рибозы)

Скачать (171KB)
Метаданные
12. Приложение
Скачать (130KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024