Comparison of methods of DNA extraction from Hermetia illucens larvae

Full Text

Черная львинка Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) – муха, обитающая в тропических регионах. Ее начинают активно использовать в качестве альтернативного источника пищи для сельскохозяйственных животных из-за большого содержания белка (42%) и жира (29%), высокой конверсии корма, способности личиночной стадии питаться вторичными органическими ресурсами (навоз, пищевые отходы, пшеничные отруби и другие). [6, 11] Помимо экономических преимуществ, ее применение способно снизить неблагоприятное воздействие сельского хозяйства на окружающую среду из-за меньших затрат водных и земельных ресурсов. В 2023 году Hermetia illucens, согласно распоряжению Правительства № 2761-р, получила официальный статус сельскохозяйственной продукции в РФ и была включена в раздел «Кормовые культуры полевого возделывания, продукция кормопроизводства прочая». Но в отечественной литературе очень мало данных по применению молекулярно-генетических методов в отношении черной львинки и практически полностью отсутствует информация о способах выделения из нее ДНК. [7]

Для генетического анализа требуется достаточная концентрация ДНК, ее целостность и высокая степень очистки. Впервые ДНК была выделена в 1869 году, затем методика экстракции видоизменялась и модифицировалась. [10] Первый этап выделения нуклеиновых кислот (НК) – разрушение клеток физическими, химическими или ферментативными методами. [8] Нарушение целостности плазматической мембраны приводит к выходу содержимого клетки в экстракционный раствор. К физическим способам разрушения относят ультразвук, пропускание клеток через узкое отверстие под давлением (French-press), многократные циклы замораживания/оттаивания и другие, к химическим – использование различных поверхностно-активных веществ (ПАВ), таких как SDS, тиоционат гуанидина, CTAB, Triton X-100. Они способствуют высвобождению липидов и белков плазматической мембраны, приводя к ее разрушению. Существуют анионные, катионные и неионогенные ПАВ. [3] К первым относят додецилсульфат натрия (SDS) – мощный детергент, разрушающий липидно-белковые мембранные комплексы и приводящий к денатурации белков вследствие приобретения ими сильного отрицательного заряда. Классическое катионное ПАВ – бромид цетилтриметиламмония (CTAB), который повышает проницаемость мембраны, что проводит к ее лизису. Также он способствует осаждению кислых полисахаридов и НК из растворов с низкой ионной силой. Если ионная сила растворов высокая, CTAB образует комплексы с белками и не осаждает НК. Таким образом, выделение ДНК CTAB-методом подходит для организмов, которые продуцируют большое количество полисахаридов: растения, насекомые, некоторые грамотрицательные бактерии. Triton-x – неионогенное ПАВ, обладающее менее сильным денатурирующим эффектом, что приводит к сохранению белками третичной структуры. Ферментативные методы включают применение различных ферментов, в том числе лизоцима, для лизиса бактериальных клеток. Выделению ДНК способствует присутствие в лизирующем буфере хелатирующих агентов, таких как EDTA. Они связываются с двухвалентными катионами кофакторов нуклеаз (Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ и другие) и предотвращают деградацию ДНК этими ферментами. Следующий этап выделения ДНК – ее очистка. Известно, что НК в клетках связаны с различными высокоспецифичными белками. Для их удаления можно использовать протеазы – ферменты, расщепляющие белки (протеиназа К) или детергенты, вызывающие их денатурацию (SDS). Помимо ДНК, в клетках присутствует РНК, для ее удаления часто применяют на соответствующем этапе РНКазу А или хлорид лития. Затем следует стадия очистки экстрагированной ДНК от белков, полисахаридов и ингибирующих веществ. В ряде методик для этой цели требуются органические растворители: фенол, хлороформ, изоамиловый спирт. [5] Применение смеси фенол-хлороформ приводит к разделению раствора на две фазы – водную и органическую. Таким образом, после центрифугирования в верхней водной фазе остаются НК, а в нижней органической – белки и гидрофобные липопротеины. Распространен способ очистки с использованием спин-колонок. Метод основан на избирательном связывании положительно заряженных частиц кремнезема (SiO₂) с отрицательно заряженными молекулами ДНК в растворах с высокой ионной силой. В результате нагревания в элюирующем буфере связи ослабевают, и очищенная ДНК выходит в раствор. [4] Последний этап выделения ДНК – осаждение в 96% этиловом спирте и растворение в дистиллированной воде или буфере TE.

Выделение ДНК из насекомых требует оптимизации и модификации существующих методов.

Цель работы – изучение основных методов экстрагирования ДНК из различных биологических материалов и возможности их использования в выделении ДНК из личинок Hermetia illucens.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования – личинки Hermetia illucens, выращенные в лаборатории промышленных биотехнологических инноваций ВНИИПД. Развитие, рост и размножение насекомых происходило в оборудованном инсектарии со световыми лампами при постоянно заданных параметрах температуры (25°С) и влажности воздуха (55 ± 5%). После достижения определенной стадии развития личинки помещали в морозильную камеру (минус 20 °С). Перед началом экстракции ДНК замороженных насекомых взвешивали, на один образец брали 200 ± 20 мг, затем помещали в ступку, где гомогенизировали в жидком азоте. Полученную субстанцию переносили в пробирку для дальнейшей работы по выделению ДНК.

Для разрушения клеток использовали детергенты: тиоцианат гуанидина (Helicon, Россия), CTAB, SDS (neoFroxx, Германия). В качестве вспомогательного хелатирующего агента был использован EDTA («neoFroxx», Германия). Длительность клеточного лизиса во всех случаях составила 1, 2 и 3 ч.

Выделяли ДНК с помощью коммерческого набора СОРБ-ГМО-Б («Синтол», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

К гомогенизированным личинкам добавляли 700 мкл лизирующего буфера (500 мМ Tris-HCl, 240 мМ тиоцианата гуанидина). Лизис проводили на автоматической мешалке при комнатной температуре.

– 1 мл CTAB. Лизис – в твердотельном термостате с регулярным перемешиванием при 65°С. К некоторым образцам добавляли 1% SDS.

– 700 мкл лизирующего раствора (TE, 0,5М EDTA, 1% SDS). Лизис – на автоматической мешалке при комнатной температуре.

Очищали ДНК фенолом (Медиген, Россия) и хлороформом (ЭКОС-1, Россия), осаждали – с участием 96%-го этилового спирта.

К полученному лизату добавляли 1/10 объема 2M NaCl и равный объем охлажденного фенола. Активно перемешивали в течение 10 мин., центрифугировали 10 мин. при 4000 об/мин., супернатант переносили в отдельные пробирки. Добавляли равный объем фенола, активно перемешивали (10 мин.), центрифугировали 10 мин. при 4000 об/мин., супернатант переносили в отдельные пробирки. Добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа в соотношении 1:1. Активно перемешивали в течение 10 мин., центрифугировали 10 мин. при 4000 об/мин., супернатант переносили в отдельные пробирки. Добавляли равный объем хлороформа. Активно перемешивали 10 мин., центрифугировали 10 мин. при 4000 об/мин., супернатант переносили в отдельные пробирки. Добавляли 1/10 объема 3М ацетата натрия и два объема 96% этанола. Образцы помещали в морозильную камеру (минус 20°С) на 24 ч. Центрифугировали 5 мин. при 13000 об/мин., супернатант переносили в отдельные пробирки и промывали 70%-м этиловым спиртом. Осадок сушили при комнатной температуре и растворяли в дистиллированной воде.

Электрофорез выделенной ДНК проходил в 1%-м агарозном геле при напряжении 90V в течение 1 ч в ТАЕ буфере (2М Tris, 1M уксусная кислота, 50 мМ EDTA, pH – 8). После растворения агарозы в ТЕ буфере (10 мМ Tris, 1 мМ EDTA) в раствор вносили 5 мкл бромистого этидия. В одну лунку геля – 3 мкл образца. В работе использовали электрофоретическую камеру Biorad (США). В качестве стандартов молекулярного веса на одну дорожку наносили 3 мкл Lambda DNA/HindIII Marker (Thermo Scientific, США). Детекцию результатов осуществляли при помощи трансиллюминатора Super-Bright (Vilber, Франция) и гель-документирующей системы Doc-Print CX3 (Vilber, Франция). Концентрацию приблизительно определяли в программе ImageJ по интенсивности свечения полосы ДНК в сравнении со стандартами молекулярного веса известной концентрации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Метод экстракции с применением коммерческого набора ГМО-СОРБ-Б основан на лизисе клеток со CTAB, очистке хлороформом, сорбции ДНК на силиконизированных частицах и ее последующем осаждении. Высокомолекулярная ДНК визуально заметна в образцах, которые были подвергнуты лизису в течение 1 ч, ее размер ориентировочно составляет 23 kb, концентрация – 580 нг/мкл (рис.1). В образцах с увеличением времени лизиса до 2 и 3 ч были выделены, в основном, низкомолекулярные фрагменты, а высокомолекулярная ДНК практически отсутствовала. Такие результаты, вероятно, связаны с низкой эффективностью данного набора в применении к насекомым, так как основная область его использования в соответствии с инструкцией – растительные и пищевые субстраты. Рекомендованная длительность лизиса для него составляет 1 ч, а увеличение времени могло негативно сказаться на результатах. В работе [7], где также был набор ГМО-СОРБ-Б, концентрация оказалась выше 70 нг/мкл. Преимущество этого способа выделения ДНК – быстрота и отсутствие необходимости работы с фенолом (токсичный реактив).

 

Рис. 1. Электрофореграмма результатов выделений ДНК Hermetia illucens с использованием коммерческого набора ГМО-СОРБ-Б. М – маркер: первая цифра образца обозначает длительность лизиса, вторая – номер повторности. То же на рис. 2–5.

 

В научной литературе отсутствуют данные о выделении ДНК из насекомых с помощью тиоцианата гуанидина. Результаты электрофоретического разделения ДНК, выделенной при его применении, представлены на рисунке 2. Наибольшая концентрация ДНК характерна для образцов, подвергнутых лизису в течение 3 ч – 650 нг/мкл. Размер экстрагированной ДНК ориентировочно соответствует 23 kb. В образцах, подвергнутых лизису в течение меньшего количества времени, концентрация ДНК оказалась ниже – 300…350 нг/ мкл. Во всех образцах видны низкомолекулярные фрагменты ДНК, что может быть следствием активности клеточных нуклеаз при отсутствии хелатирующих агентов.

 

Рис. 2. Электрофореграмма результатов выделений ДНК Hermetia illucens с использованием тиоцианата гуанидина.

 

Метод, основанный на CTAB, преимущественно применяют при выделении ДНК из растений, но некоторые исследования показывают его эффективность в отношении насекомых. [1] Несмотря на схожесть метода с коммерческим набором ГМО-СОРБ-Б, полученные результаты достаточно сильно различаются. Выделенная ДНК во всех образцах представлена в основном высокомолекулярным фрагментом размером 23 kb, что свидетельствует о низкой степени деградации (рис. 3). Наибольшая концентрация ДНК характерна для образцов, подвергнутых лизису в течение 3 ч – 750 нг/ мкл. Во всех остальных образцах концентрация ДНК – 600…650 нг/мкл. В работе [9], где оценивали выделение ДНК из тли Aphis gossypii (Hemiptera: Aphididae) с помощью данного метода, были получены похожие электрофореграммы, но концентрация ДНК оказалась меньше – 120 нг/мкл. В другой работе, где экстракцию ДНК осуществляли из Holcocerrus hippophaecolus (Lepidoptera: Cossidae), также были получены схожие электрофореграммы, но концентрация была выше – 2140 нг/мкл. [2]

 

Рис. 3. Электрофореграмма результатов выделений ДНК Hermetia illucens с использованием CTAB.

 

В следующем эксперименте мы оценивали влияние совместного эффекта CTAB и SDS на экстракцию ДНК (рис. 4). Размер экстрагированной высокомолекулярной ДНК примерно соответствует результатам предыдущего эксперимента (23 kb), однако концентрация оказалась значительно ниже – 380…460 нг/мкл. Возможно, совместное действие двух детергентов имеет негативный эффект на экстракцию ДНК. Полученные данные коррелируют с результатами работы. [2] Увеличение длительности лизиса в этом эксперименте несущественно повлияло на результаты.

 

Рис. 4. Электрофореграмма результатов выделений ДНК Hermetia illucens с использованием CTAB и SDS.

 

Мы провели лизирование клеток с участием SDS в присутствии хелатирующего агента EDTA высокой концентрации (рис. 5). Высокомолекулярная геномная ДНК светится в виде компактной узкой полосы, что свидетельствует о высоком качестве очистки и низкой степени фрагментации. Ее размер ориентировочно составляет 23 kb. Концентрация ДНК во всех пробах примерно одинаковая – 50 нг/мкл. Для данного метода характерно отсутствие низкомолекулярных фрагментов, вероятно, из-за инактивации клеточных нуклеаз посредством EDTA.

 

Рис. 5. Электрофореграмма результатов выделений ДНК Hermetia illucens с использованием SDS и EDTA.

 

Выводы. Обобщены и оценены разные методы экстрагирования ДНК из личинок Hermetia illucens. Наибольшая концентрация ДНК наблюдается при использовании CTAB-метода – 750 нг/мкл. Для дальнейшего использования этой ДНК в молекулярно-генетических анализах необходима дополнительная очистка, что приведет к снижению концентрации. С SDS в присутствии большого количества EDTA удается добиться высокой степени очистки и низкой фрагментации, однако выход ДНК существенно снижен (50 нг/ мкл). Таким образом, такую ДНК можно использовать для генетических анализов. Впервые получены данные о применении тиоцианата гуанидина для выделения ДНК из насекомых, свидетельствующие о достаточной степени его релевантности относительно Hermetia illucens. Все вышеперечисленные методы приводили к сопоставимому или более высокому выходу ДНК, по сравнению с коммерческим набором ГМО-СОРБ-Б. Увеличение длительности лизиса до 3 ч в методах, основанных на тиоцианате гуанидина и CTAB, повышает концентрации ДНК.

About the authors

G. I. Sutula

All-Russian Research Institute for Food Additives – Branch of V.M. Gorbatov Federal Research Center for Food Systems of RAS

Author for correspondence.
Email: capitals2016@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-2781-9035

Junior Researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

S. I. Loskutov

All-Russian Research Institute for Food Additives – Branch of V.M. Gorbatov Federal Research Center for Food Systems of RAS

Email: capitals2016@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9377-5515

PhD in Agricultural Sciences, Senior Researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

V. Yu. Sitnov

All-Russian Research Institute for Food Additives – Branch of V.M. Gorbatov Federal Research Center for Food Systems of RAS

Email: capitals2016@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1927-1997

Director, V.M.Gorbatov Research Center for Food Systems

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files