Molecular marking in a white cabbage selection for resistance to Alternaria Blight
- Authors: Dubina E.V.1,2, Makukha Y.A.1, Garkusha S.V.1, Simonenko D.S.2, Gorun O.L.1, Lesnyak S.A.1
-
Affiliations:
- Federal Scientific Rice Centre
- Kuban State Agrarian University named after I.T. Trubilin
- Issue: No 2 (2024)
- Pages: 8-10
- Section: Crop Production and Selection
- URL: https://permmedjournal.ru/2500-2082/article/view/659338
- DOI: https://doi.org/10.31857/S2500208224020029
- ID: 659338
Cite item
Full Text
Abstract
In the presented study, the polymorphism of SSR loci was studied on the basis of the resistance of white cabbage to alternariosis. This work was carried out in order to identify effective and informative ISSR markers for the identification of donor alleles of resistance to alternariosis in the genotypes of hybrid plants of culture. Of the 20 tested markers, only 3 (PBCESSRJU13, PBCESSRJU6, NI-F02a) demonstrate an allelic difference between the isogenic lines of white cabbage contrasting in resistance to Alternaria Blight. They will become the basis for subsequent studies on the analysis of cleavage in segregating populations and the determination of informative DNA marker systems co-inherited with the sign of resistance of cabbage to alternariosis.
Keywords
Full Text
Капуста белокочанная (Brassica oleracea L.) – наиболее востребованная овощная культура среди всех представителей рода Brassica. Ее пищевая ценность объясняется высоким содержанием биологически активных веществ, в том числе, фенольных соединений, выполняющих важные физиологические функции в живом организме, а также биофлавоноидов, которые регулируют многие реакции метаболизма, участвуют в окислительно-восстановительных процессах, обладают широким спектром биологической активности. [2]
Среди деструктивных болезней данной культуры, значительно снижающих урожайность, особое внимание стоит уделить альтернариозу (черная пятнистость), основные возбудители которого – фитопатогенные грибы видов Alternaria brassicae, Alternaria brassicicola. [3] Поражение может происходить на любом этапе развития растения. На стадии сеянцев появляются черные некротические полоски и пятна на семядолях и подсемядольных коленах, что приводит к их увяданию. У более взрослых растений на кроющих листьях кочана есть темные зональные пятна, покрытые рыхлым сажистым налетом спороношения. Пятна часто с желтой окантовкой. Середина их вскоре становится желто-коричневой и впоследствии может выпасть, в результате чего листья приобретают изрешеченный вид. Часто альтернариозом поражаются кочаны капусты, при этом на наружных листьях образуется черный налет, а затем и черные некротические пятна, может возникнуть ранняя дефолиация и гибель растения. [7]
По результатам анализа литературных источников, исследования в области молекулярного маркирования генов (локусы) устойчивости к альтернариозу в основном посвящены представителям масличных культур семейства Brassicaceae (Brassica juncea, Brassica carinata). [4, 5, 8] Работы по определению информативных маркерных систем на данный признак у капусты белокочанной не проводили.
Цель исследования – поиск информативных SSR-маркеров для идентификации в генотипах растений капусты белокочанной донорных аллелей устойчивости к альтернариозу.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект изучения – контрастные формы капусты белокочанной (устойчивая изогенная линия 42 и восприимчивая изогенная линия 32), отобранные в отделе овощекартофелеводства ФГБНУ «ФНЦ риса».
ДНК из листьев капусты выделяли по схеме Мюррея и Томпсона [6] c использованием цетилтриметиламмоний бромида (СТАВ) в качестве лизирующего буфера растительных клеток.
В молекулярно-генетических исследованиях по идентификации аллелей устойчивости к альтернариозу у капусты белокочанной применяли SSR-маркеры. [4, 5, 8] Нуклеотидные последовательности праймеров представлены в таблице.
Нуклеотидная последовательность использованных в исследовании праймеров
Маркер | Последовательность праймеров |
PBCESSRJU1 | F: GGTGAAAGAGGAAGATTGGT R: AGGAGATACAGTTGAAGGGTC |
PBCESSRJU2 | F: TTCACATCTTCTTCATCTTCC R: TTGCTATTCGTTCTCAGTCTC |
PBCESSRJU3 | F: CCTCTTTTAATTCAAACAAGAAATCA R: TTCGGACAATGGCAGTGATA |
PBCESSRJU4 | F: CACCTTATCATCTCTCTATCCC R: CCTCTGTTTCTCTCCTTGTG |
PBCESSRJU5 | F: GGCACGTACATGGAGGATTC R: TGTTGGTCGAGCTGTTTCAG |
PBCESSRJU6 | F: TCTCTCACCTGCCTTGTCT R: ACTCCTCGGTAATGCCTC |
PBCESSRJU7 | F: TACCACTCCCTAACCGCA R: ATCACCTTGAGAGCGAAG |
PBCESSRJU8 | F: CGCTCTTCTTCTTAGTCCTCT R: ACTTCATCTTCACCGCCT |
PBCESSRJU9 | F: CCCTACCGCTGGCTAGACTT R: GCATCATGACCAACTATCAACC |
PBCESSRJU10 | F: GCGGCGTAGGTACTGGAG R: AGCCATCGAGCCATTCAG |
PBCESSRJU11 | F: CGGTGTTAAAAGGGTTATTTC R: ATCTCCAATCAAAAAGCAAAC |
PBCESSRJU12 | F: AAGCTCAGATCGTTTGCG R: AGATGAATGTGAAATAGGGGT |
PBCESSRJU13 | F: TTGCTTTGACTGAGCCTG R: CCATTCATGGAGCCTGTAG |
PBCESSRJU14 | F: GCGAAGCAGTCTGAAACC R: GCGAATCCGGTGAGAAAC |
PBCESSRJU15 | F: GGATCTCATGTTCACTGCTG R: TGATTACATACCAAATATGAG |
PBCESSRJU16 | F: TCCTCACTTTCTTGGCATC R: ACTGAAAAGACCACTACCACCA |
Ni2D10 | F: GATGCCCCAAATCTGTTACG R: CAATTCGTGAAAAATAGCCG |
Ni3C05 | F: TTTCGTGCTTTGGTGTGAAG R: TCCCCAAATCGAACCATAAG |
BRMS-011 | F: GAACGCGCAACAACAAATAGTG R: CGCGTCACAATCGTAGAGAATC |
NI-F02a | F: TGCAACGAAAAAGGATCAGC R: TGCTAATTGAGCAATAGTGATTCC |
Копирование участков ДНК проводили в амплификаторах Терцик и Bio Rad с оптимизацией условий ПЦР. При апробации маркеров использовали протокол: первичная денатурация – 15 мин., следующие 35 циклов: денатурация при 95°С – 60 сек., отжиг праймеров (54°С) – 60 сек., элонгация (72°С) – 60 сек., финальная элонгация (72°С) – 10 мин.
Разделяли продукты амплификации методом электрофореза в 8%-ом полиакриламидном геле (180 мин.) при напряжении 220 В. [1] Визуализировали результаты электрофореза в УФ-свете с помощью гель-документирующей системы GelDocXR+.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В молекулярно-генетических исследованиях по выявлению информативных ДНК-маркерных систем для идентификации аллелей устойчивости к альтернариозу апробировали 20 SSR-маркеров на контрастных по резистентности к альтернариозу изогенных линиях капусты белокочанной, три из которых оказались наиболее полиморфными (рис. 1–3, 4-я стр. обл.).
Рис. 1. Визуализация продуктов ПЦР по локусу PBCESSRJU13 в 8%-ом ПААГ. Мт - маркер молекулярной массы; У - изогенная устойчивая линия 42; Н/У - изогенная неустойчивая линия 32 (то же на рис. 2,3)
Рис. 2. Визуализация продуктов ПЦР по локусу PBCESSRJU6 в 8%-ом ПААГ
Рис. 3. Визуализация продуктов ПЦР по локусу NI-F02a в 8%-ом ПААГ
На рисунке 1 видно, что маркер PBCESSRJU13 выявляет полиморфизм между контрастными по устойчивости к альтернариозу формами капусты белокочанной. С помощью маркера молекулярной массы определен размер ПЦР-продуктов: устойчивые аллели – 408 и 1000 п.н., неустойчивые – 354 и 948 п.н.
На электрофореграммах видна аллельная разница между изучаемыми контрастными формами капусты белокочанной (рис. 2, 3, 4-я стр. обл.). Размер аллелей устойчивости по локусу PBCESSRJU6 – 142, 191, 370 и 432 п.н., аллеля восприимчивости – 318 п.н, по локусу NI-F02a размер обнаруженных ПЦР-продуктов составляет 400, 650 и 975 п.н. (устойчивые), 700 п.н. (неустойчивые).
При апробации остальных 17 маркеров полиморфизма между контрастными изогенными линиями обнаружено не было.
Таким образом, только PBCESSRJU13, PBCESSRJU6, NI-F02a демонстрируют аллельную разницу между контрастными по резистентности к альтернариозу изогенными линиями капусты белокочанной. В последующих исследованиях отобранные маркеры будут взяты для анализа расщепления и изучения их сонаследования с признаком устойчивости к альтернариозу на растениях сегрегирующих популяций.
About the authors
E. V. Dubina
Federal Scientific Rice Centre; Kuban State Agrarian University named after I.T. Trubilin
Author for correspondence.
Email: lenakrug1@rambler.ru
Grand PhD in Biological Sciences, Professor of the RAS
Russian Federation, Krasnodar; KrasnodarYu. A. Makukha
Federal Scientific Rice Centre
Email: lenakrug1@rambler.ru
PhD in Biological Sciences
Russian Federation, KrasnodarS. V. Garkusha
Federal Scientific Rice Centre
Email: lenakrug1@rambler.ru
Corresponding Member of the RAS
Russian Federation, KrasnodarD. S. Simonenko
Kuban State Agrarian University named after I.T. Trubilin
Email: lenakrug1@rambler.ru
PhD Student
Russian Federation, KrasnodarO. L. Gorun
Federal Scientific Rice Centre
Email: lenakrug1@rambler.ru
Junior Researcher
Russian Federation, KrasnodarS. A. Lesnyak
Federal Scientific Rice Centre
Email: lenakrug1@rambler.ru
Junior Researcher
Russian Federation, KrasnodarReferences
- Kutlunina N.A., Ermoshin A.A. Molekulyarno-geneticheskie metody v issledovanii rasteniy. Ekaterinburg, 2017. 142 s.
- Makukha Yu.A., Dubina E.V. Razrabotka metodologii otsenki ustoichivosti kapusty belokochanoy k Xanthomonas campestris s primeneniem SSR-markerov. Risovodstvo. 2019. № 3 (44). С. 27–32.
- Doullah M.A.U., Meah M.B., Okazaki K. Development of an effective screening method for partial resistance to Alternaria brassicicola (dark leaf spot) in Brassica rapa. Eur. J. Plant. Pathol. 2006; 116 (1): 33–43. https://doi.org/10.1007/s10658-006-9035-2
- Ghosh S., Mazumder M., Mondal B. et al. Morphological and SSR marker-based genetic diversity analysis of Indian mustard (Brassica juncea L.) differing in Alternaria brassicicola tolerance. Euphytica. 2019. V. 215. P. 206–224. https://doi.org/10.1007/s10681-019-2523-1
- Hopkins C.J., Cogan N.O.I., Hand M. et al. Sixteen new simple sequence repeat markers from Brassica juncea expressed sequences and their cross-species amplification. Mol. Ecol. Notes. 2007. V. 7 (4). P. 697–700. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2007.01681.x
- Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 1980. V. 10. P. 4321–4325.
- Nowicki M., Nowakowska M., Niezgoda A., Kozik E. Alternaria black spot of crucifers: symptoms, importance of disease, and perspectives of resistance breeding. Veg. Crops Res. Bull. 2012. V. 76 (1). P. 5–19. https://doi.org/10.2478/v10032-012-0001-6
- Pratap P., Thakur A.K., Meena P.D. et al. Genetic diversity assessment in Indian mustard (Brassica juncea L.) for Alternaria black leaf spot tolerance using SSR markers. J. Oilseed Brassica. 2015. V. 6 (1). P. 175–182.
Supplementary files
