STREPTOCOCCUS MUTANS - POSSIBLE RISK FACTOR FOR ANTIBIOTIC RESISTANCE PREVALENCE

Cover Page

Abstract


Aim. To assess the prevalence of erythromycin and tetracycline-resistant S.mutans strains, isolated from child dental deposit; to determine the leading mechanism of their resistance to microlides. Materials and methods. Eighty six S. mutans strains, isolated from the dental deposits of children aged 6-17 years were studied. Screening of erythromycin resistance was fulfilled with two methods - phenotypical and genotypical, tetracycline - with phenotypical alone. Results. The share of S. mutans isolates, phenotypically resistant to erythromycin, was 16 % , to tetracycline - 26,7 %. The prevailing molecular-genetic mechanism of erythromycin resistance - presence of mef A-gene (78,6 % of all erythromycin-resistant strains); 10,5 % of all the studied S. mutans strains is a potential reservoir of antibiotic resistance genes ( erm B and mef A) in the horizontal transmission.

Full Text

Введение S. mutans из группы Viridans Streptococci (VGS) являются частью нормальной микрофлоры ротовой полости, которая играет важнейшую роль в подавлении колонизации полости рта другими патогенами. Однако вирулентные штаммы S. mutans способны инициировать развитие кариеса зубов. У пациентов со снижением иммунитета (нейтропения, иммунокомпромисс) их наличие считается фактором риска аутоиммунного нефрита, неалкогольного стеатогепатита, атеросклероза, они также способны вызывать серьезные инфекции - эндокардит, сепсис и менингит [1-4, 6, 7]. Кроме того, эти бактерии могут обмениваться генетическим материалом с другими микроорганизмами, разделяющими их среду обитания. Известно, что у S. mutans и других VGS растет устойчивость ко многим антибиотикам, включая макролиды и тетрациклины [4, 9]. Стрептококки приобретают устойчивость к макролидам тремя механизмами: 1) посттранскрипционной модификацией 23S субъединицы рРНК аденин-N6-метилтрансферазами (кодируемые erm-геном); 2) действием эффлюксного насоса, опосредованным геном mef A, что помогает создать низкую концентрацию внутриклеточного лекарственного средства; 3) рибосомными мутациями в ключевом сайте при связывании с антибиотиками. Наиболее распространенный способ обмена детерминантами резистентности среди близкородственных бактерий происходит через генетический перенос in vivo. В одном из исследований была показана сильная корреляционная связь между концентрацией антибиотиков в слюне и ростом уровня колонизации резистентных штаммов S. mutans [12]. И, как следствие, S. pneumoniae или S. pyogenes и многие другие патогенные стрептококки становятся все более устойчивыми к макролидам. Наконец, индукция устойчивости к макролидам также может непреднамеренно способствовать устойчивости к тетрациклину, так как их основные детерминанты резистентности - гены erm B и tet M - часто располагаются на одном и том же мобильном элементе. Таким образом, потенциальную роль S. mutans в качестве резервуара устойчивости к макролидам нельзя игнорировать. Цель исследования - определение распространенности эритромицин- и тетрациклинрезистентных штаммов S. mutans, установление основного механизма приобретения резистентности. Материалы и методы исследования Микробиологическому исследованию был подвергнут зубной налет 80 детей в возрасте 6-17 лет, полученный при профилактическом осмотре в 2016-2017 гг. Пробы зубного налета отбирались стерильными деревянными зубочистками, образцы сразу помещались в пробирки Eppendorf. Содержимым пробирки являлась транспортная среда - триптозно-соевый бульон объемом 200 мкл с содержанием 20%-ной сахарозы и 10 %-ной глюкозы (либо THB, BHI), в который предварительно опускали диск с антибиотиком бацитрацином концентрацией 0,04 ед. в качестве селективного фактора. Пробы хранились при температуре 4 °С и доставлялись в лабораторию в первые сутки после отбора. Культивирование S. mutans осуществлялось при t = 37 °C на дифференциально-диагностических плотных питательных средах Mitis Salivarius agar в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов. Чувствительность к эритромицину, клиндамицину и тетрациклину определялась диско-диффузионным методом коммерческими дисками, минимальные ингибирующие концентрации интерпретировались в соответствии с критериями NCCLS (США) [9]. Изоляты S. mutans изучены на устойчивость к макролидам, был определен их фенотип методом «двойных дисков» на чашках Петри с Muller - Hinton агаром. Для этого диски с эритромицином (15 мкг) и клиндамицином (2 мкг) были размещены на расстоянии 16 мм друг от друга. После инкубации отмечалиcь два различных вида устойчивых фенотипов [10]. Устойчивость к клиндамицину и эритромицину интерпретировалась как конститутивный тип макролида - линкозамидстрептомина (cMLSB). Восприимчивость к клиндамицину и резистентность к эритромицину без Д-зоны дифференцировалась как фенотип М. Чувствительность к тетрациклинам также определялась диско-диффузионным методом с концентрацией диска 30 мкг. Геномная ДНК выделялась с помощью набора химических реагентов для получения ДНК из проб («ДНК-экспресс», производство НПФ «Литех», г. Москва) в соответствии с инструкциями производителя. Наличие генов erm В и mef А определяли методом ПЦР-амплификации, используя ранее описанные специфичные праймеры 10-превалентен. Амплификация выполнялась в термоциклере CFX-96 (BIO-RAD, США) с последующей электрофоретической оценкой результатов реакции. Каждый раз при постановке реакции совместно с образцами ставились положительный и отрицательный контроль для предотвращения получения ложных результатов. Анализ ПЦР-продуктов осуществлялся методом гель-электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с окраской ДНК этидиумом бромида (10 MG/ML) производства «Helixon», г. Москва, и визуализацией в УФ-лучах на трансиллюминаторе «UVT1» производства «Biokom». В качестве стандарта для оценки длины полученных ампликонов использовали маркер длин фрагментов с шагом в 100 пар нуклеотидов производства НПО «Сибэнзим» (8 мкл маркера на дорожку). Электрофорез осуществлялся при помощи источника питания для электрофореза нуклеиновых кислот в агарозных и акриламидных гелях «Эльф-4» и «Эльф-8». Параметры электрофореза: 180 В, 19,0 Вт, 180 мА в течение 25 минут. Результаты и их обсуждение За время обследования были выделены 86 штаммов S. mutans от 80 детей. Из 86 тестируемых изолятов S. mutans у 11 (12,8 %) обнаружен M-фенотип резистентности к макролидам, у 3 (3,5 %) - cMLSB-фенотип. Индуцибельный тип iMLSB выявлен не был. Остальные 72 (83,7 %) штамма были восприимчивы к антибиотикам. Количество фенотипически резистентных штаммов S. mutans к тетрациклину - 23 изолята (26,7 %). Среди 14 резистентных к макролидам изолятов 11 (78,6%) имели mef A-ген. Один (33,3 %) штамм с cMLSB-фенотипом был позитивен на ген erm B. М-фенотип был доминирующим (78,6 %) среди устойчивых к эритромицину штаммов. Другие исследования также показали, что М-фенотип преобладает среди VGS из ротоглотки [5]. В нашем исследовании ген erm B обнаруживался в изолятах с cMLSB-фенотипом, об этом также сообщают и другие исследователи [5, 11]. Ген mef A был обнаружен исключительно у штаммов с фенотипом М. Доля изолятов S. mutans, фенотипически резистентных к эритромицину, составила более 16,0 %, к тетрациклину - 26,7 %. Преобладающий молекулярно-генетический механизм резистентности к эритромицину - наличие mef A-гена (78,6 % всех эритромицинрезистентных штаммов). Из всех исследованных штаммов S. mutans 10,5 % являются потенциальным резервуаром генов антибиотикорезистентности (erm B и mef A) в горизонтальной передаче. Выводы 1. Обнаружена высокая частота резистентности штаммов S. mutans к макролидам и тетрациклинам у детей в Санкт-Петербурге. 2. Необходим мониторинг резистентности к антибиотикам как S. mutans, так и других видов стрептококков, в том числе и молекулярно-генетический. Это поможет координировать направления индивидуальной (ориентированной на пациента) и популяционной терапевтической стратегии.

About the authors

T V Brodina

Email: brodina23@gmail.com

A V Lyubimova


A E Feting


A V Silin


R F Yusupova


A V Kiselev


E A Klimova


References

  1. Bruckner L., Gigliotti F. Viridans group streptococcal infections among children with cancer and the importance of emerging antibiotic resistance. Semin Pediatr Infect Dis 2006; 17: 153-160.
  2. Balletto E., Mikulska M. Bacterial infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. Mediterr J Hematol Infect Dis 2015; 7: 101-109.
  3. Douglas C. Identity of viridans streptococci isolated from cases of infective endocarditis. J Med Microbiol 1993; 39: 179-182.
  4. Gordon, K.A., Beach M.L., Biedenbach D.J., Jones R.N., Rhomberg P.R., Mutnick A.H. Antimicrobial susceptibility patterns of hemolytic and viridans group streptococci: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997-2000). Diag Microbiol Infect Dis 2002; 43: 157-162.
  5. Ioannidou S., Papaparaskevas J., Tas-sios P.T., Foustoukou M., Legakis N.J., Vatopoulus A. Prevalence and characterization of the mechanisms of macrolide, lincosamide and streptogramin resistance in viridans group streptococci. Int J Antimicrob Agents 2003; 22: 626-629.
  6. Kennedy H.F., Gemmell C.G., Bagg J., Gibson B.E.S., Michie J.R. Antimicrobial susceptibility of blood culture isolates of viridans group streptococci: relationship to a change in empirical antibiotic therapy in febrile neutropenia. J Antimicrob Chemother 2001; 47: 693-696.
  7. Luna V.A., Coates P., Eady E.A., Cove J.H., Nguyen T.T., Roberts M.C. A variety of gram-positive bacteria carry mobile mef genes. J Antimicrob Chemother 1999; 44: 19-25.
  8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing - Thirteenth Informational Supplement M100-S13. NCCLS, Wayne, PA, USA 2003.
  9. Seppala H., Haanpera M., Al-Juhaish M., Jarvinen H., Jalava J., Huovinen J. Antimicrobial susceptibility patterns and macrolide resistance genes of viridans group streptococci from normal flora. J Antimicrob Chemother 2003; 52: 636-644.
  10. Seppala H., Nissinen A., Yu Q., Huovinen P. Three different phenotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes in Finland. J Antimicrob Chemother 1993; 32: 885-891.
  11. Seppala H., Skurnik M., Soini H., Roberts M.C., Huovinen P. A novel erythromycin resistance methylase gene (ermTR) in Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 257-262.
  12. Soriano F., Rodriguez-Cerrato V. Pharmacodynamic and kinetic basis for the selection of pneumococcal resistance in the upper respiratory tract. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2002; 50: 51-58.

Statistics

Views

Abstract - 264

PDF (Russian) - 116

Cited-By


PlumX

Comments on this article

Comments on this article

View all comments

Copyright (c) 2017 Brodina T.V., Lyubimova A.V., Feting A.E., Silin A.V., Yusupova R.F., Kiselev A.V., Klimova E.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies