Особенности влияния лизоцима на кинетику роста грибков candida albicans

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день носительство грибков Сandida albicans встречается среди 25 % людей. Известно, что Candida spp. являются условно-патогенным микроорганизмом и входят в состав резидентной микрофлоры полости рта. При снижении иммунитета, например при продолжительном употреблении антибиотиков, цитостатиков, кортикостероидов и некоторых других соматических заболеваниях, происходит увеличение их пролиферативной активности, что приводит к кандидозу. Заболевание имеет различные клинические проявления, наиболее частыми из них являются появление белесоватого творожистого налета на слизистой полости рта, губ, задней стенки глотки. Кроме косметических недостатков, заболевание проявляется дискомфортом и жжением в области поражения. Чаще всего, при кандидозе полости рта встречается вид C. albicans [4, 5].

Антимикотической активностью обладает ротовая жидкость, которая представляет совокупность слюны, продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, десневой жидкости, слущенного эпителия, остатков пищи. Ведущую роль в реализации протективной функции играет ферментный состав, например амилаза, лизоцим и другие [1]. Лизоцим (мурамидаза) – фермент, который принадлежит к классу гидролаз и обладает способностью к гидролизу ß-1-4-гликозидной связи между остатками N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмураминовой кислотами пептидогликана клеточной стенки бактерий. Доказана эффективность лизоцима против вирусов путем активация интерферона, а также против некоторых бактериальных токсинов. В ряде исследований показано, что фермент особенно эффективен против грамположительных бактерий, которые в составе клеточной стенки имеют ß-1,4-гликозидной связи, а ее мукопептиды связаны с тейхоевыми кислотами [3]. Компоненты клеточной стенки C. albicans можно отнести к факторам патогенности, так как они активно участвуют в клеточном метаболизме, а также содержат полисахариды, которые обладают антигенными свойствами. Маннанопротеины клеточной стенки грибов Candida играют основную роль в процессах колонизации, адгезии и инвазии. Благодаря клеточной стенке и плотной микрокапсуле грибы рода Candida защищены от воздействия лекарственных веществ, что в определенной степени может быть причиной недостаточной эффективности проводимой антимикотической терапии. Хитин представляет собой полимер с β-1,4-связанными остатками N-ацетилглюкозамина и может быть мишенью действия лизоцима. Примерно 90 % этого соединения находится в области образования и отделения дочерних клеток. В этой зоне хитин участвует в построении первичной перегородки – септы между материнской и дочерней клетками – и образует жесткое кольцо, защищающее канал между ними. В латеральной клеточной стенке локализовано примерно 10 % хитина [2].

В связи со сложным строением клеточной стенки дрожжеподобных грибов влияние лизоцима на них остается до конца не выясненным.

Цель исследования – оценить динамику роста C. albicans и их биопленкообразующую активность при разной концентрации лизоцима.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования было выделено два клинических штамма C. albicans из ротовой полости клинически здоровых людей. Штаммы выделяли на среде Сабуро. Суспензию тест-штаммов вносили в лунки плоскодонного планшета, заливали бульоном Сабуро и культивировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. Каждый час производилась регистрация оптической плотности при длине волны 620 нм, что отражает число микроорганизмов. Удельная скорость роста культуры рассчитывается по данным концентрации биомассы в фазах активного роста культуры по формуле

$\mathrm{\mu }=\frac{\mathrm{In}{X}_1-\mathrm{In}{X}_0}{T_{\mathit{1}}\mathit{-}{T}_{\mathit{0}}}$

где Х₀ и Х₁ – значения биомассы, соответствующие времени роста Т₀ и Т₁.

В опытные лунки вносили лизоцим в концентрации 40 мкг/мл, что соответствует нормальному значению фермента в слюне [6], а также 0,2 мг/мл, что значительно превышает уровень здоровых лиц.

Биопленки формировали в планшетах для иммуноферментного анализа, куда вносили бульонные культуры тест-штаммов и лизоцим в соответствующих концентрациях. В контрольные лунки помещали физиологический раствор NaCl. Планшеты инкубировали при 37 °C в течение 24 ч. Затем лунки промывали и окрашивали 1%-ным спиртовым раствором основного фуксина с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя. Детекцию окрашенных экстрактов биопленок осуществляли на планшетном ридере при длине волны 492 нм. Толщину биомассы пленки, сформированной микроорганизмами, оценивали по методу [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Длительность лаг-фазы грибков в условиях нормального содержания лизоцима составляет 4 ч, после чего наступает продолжительная логарифмическая фаза, которая длится 20 ч и заканчивается максимальной стационарной фазой, когда уровень биомассы грибков достигает 0,474 усл. ед. оптической плотности, а скорость роста штамма – 0,081 усл. ед. оптической плотности в час. При повышении концентрации лизоцима лаг-фаза удлиняется и составляет 5 ч, фаза экспоненциального роста – 6 ч, после чего наступает фаза замедленного роста, продолжающаяся 1 ч. Последняя сменяется стационарной фазой, когда происходит гибель части популяции клеток. Эта фаза продолжается 10 ч. Количество C. albicans по истечении 24 ч культивирования составляет 0,468 усл. ед. оптической плотности, а скорость роста – 0,180 усл. ед. оптической плотности в час (p < 0,05). В целом скорость роста грибков в условиях повышенной концентрации лизоцима значительно превосходит скорость роста при его нормальном уровне. Однако по истечении 24 ч количество грибков в обоих штаммах имеет незначительные отличия. Можно предположить, что такое проявление активности лизоцима против дрожжеподобных грибков объясняется наличием в их клеточной стенке маннанопротеина и плотной капсулы.

Биопленкообразующая активность штаммов, культивируемых при повышенной концентрацией лизоцима, составила 0,616 усл. ед., а при нормальной – 0,114 усл. ед. (p < 0,05). В условиях повышенной концентрацией лизоцима происходит увеличение образования биопленки, что, вероятно, обусловлено усиленной пролиферацией C. albicans.

Показано, что лизоцим оказывает влияние на кинетику роста и его действие зависит от рН среды. При изучении активности фермента в среде с рН 5,0 установлено, что рост C. albicans резко снижается, т.е. можно предположить бактерицидное действие фермента. При рН среды 7,0 лизоцим также проявляет свою бактерицидную активность, однако в меньшей степени. Аналогичная зависимость активности лизоцима выявлена и при изучении биопленкообразования штаммами C. albicans.

ВЫВОДЫ

Таким образом, лизоцим меняет кинетику роста C. albicans, сокращая продолжительность экспоненциальной и удлиняя стационарную фазы роста. Кроме этого, повышенный уровень лизоцима способствует переходу грибков в планктонную форму роста, что необходимо учитывать при проведении лечения пациентов с кандидозом.

 

Рис. Кинетика роста Сandida albicans при различных концентрациях лизоцима

Об авторах

Анатолий Петрович Годовалов

Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера

Email: AGodovalov@gmail.com

к.м.н., доцент кафедры микробиологии и вирусологии

Россия, 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская 26

Данила Максимович Пастухов

Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера

Автор, ответственный за переписку.
Email: pastuhovdanilam@gmail.ru

студент стоматологического факультета

Россия, 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская 26

Список литературы

Дополнительные файлы