Characteristic features of lysocim influence on growth kinetics of candida albicans fungi

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день носительство грибков Сandida albicans встречается среди 25 % людей. Известно, что Candida spp. являются условно-патогенным микроорганизмом и входят в состав резидентной микрофлоры полости рта. При снижении иммунитета, например при продолжительном употреблении антибиотиков, цитостатиков, кортикостероидов и некоторых других соматических заболеваниях, происходит увеличение их пролиферативной активности, что приводит к кандидозу. Заболевание имеет различные клинические проявления, наиболее частыми из них являются появление белесоватого творожистого налета на слизистой полости рта, губ, задней стенки глотки. Кроме косметических недостатков, заболевание проявляется дискомфортом и жжением в области поражения. Чаще всего, при кандидозе полости рта встречается вид C. albicans [4, 5].

Антимикотической активностью обладает ротовая жидкость, которая представляет совокупность слюны, продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, десневой жидкости, слущенного эпителия, остатков пищи. Ведущую роль в реализации протективной функции играет ферментный состав, например амилаза, лизоцим и другие [1]. Лизоцим (мурамидаза) – фермент, который принадлежит к классу гидролаз и обладает способностью к гидролизу ß-1-4-гликозидной связи между остатками N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмураминовой кислотами пептидогликана клеточной стенки бактерий. Доказана эффективность лизоцима против вирусов путем активация интерферона, а также против некоторых бактериальных токсинов. В ряде исследований показано, что фермент особенно эффективен против грамположительных бактерий, которые в составе клеточной стенки имеют ß-1,4-гликозидной связи, а ее мукопептиды связаны с тейхоевыми кислотами [3]. Компоненты клеточной стенки C. albicans можно отнести к факторам патогенности, так как они активно участвуют в клеточном метаболизме, а также содержат полисахариды, которые обладают антигенными свойствами. Маннанопротеины клеточной стенки грибов Candida играют основную роль в процессах колонизации, адгезии и инвазии. Благодаря клеточной стенке и плотной микрокапсуле грибы рода Candida защищены от воздействия лекарственных веществ, что в определенной степени может быть причиной недостаточной эффективности проводимой антимикотической терапии. Хитин представляет собой полимер с β-1,4-связанными остатками N-ацетилглюкозамина и может быть мишенью действия лизоцима. Примерно 90 % этого соединения находится в области образования и отделения дочерних клеток. В этой зоне хитин участвует в построении первичной перегородки – септы между материнской и дочерней клетками – и образует жесткое кольцо, защищающее канал между ними. В латеральной клеточной стенке локализовано примерно 10 % хитина [2].

В связи со сложным строением клеточной стенки дрожжеподобных грибов влияние лизоцима на них остается до конца не выясненным.

Цель исследования – оценить динамику роста C. albicans и их биопленкообразующую активность при разной концентрации лизоцима.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования было выделено два клинических штамма C. albicans из ротовой полости клинически здоровых людей. Штаммы выделяли на среде Сабуро. Суспензию тест-штаммов вносили в лунки плоскодонного планшета, заливали бульоном Сабуро и культивировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. Каждый час производилась регистрация оптической плотности при длине волны 620 нм, что отражает число микроорганизмов. Удельная скорость роста культуры рассчитывается по данным концентрации биомассы в фазах активного роста культуры по формуле

$\mathrm{\mu }=\frac{\mathrm{In}{X}_1-\mathrm{In}{X}_0}{T_{\mathit{1}}\mathit{-}{T}_{\mathit{0}}}$

где Х₀ и Х₁ – значения биомассы, соответствующие времени роста Т₀ и Т₁.

В опытные лунки вносили лизоцим в концентрации 40 мкг/мл, что соответствует нормальному значению фермента в слюне [6], а также 0,2 мг/мл, что значительно превышает уровень здоровых лиц.

Биопленки формировали в планшетах для иммуноферментного анализа, куда вносили бульонные культуры тест-штаммов и лизоцим в соответствующих концентрациях. В контрольные лунки помещали физиологический раствор NaCl. Планшеты инкубировали при 37 °C в течение 24 ч. Затем лунки промывали и окрашивали 1%-ным спиртовым раствором основного фуксина с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя. Детекцию окрашенных экстрактов биопленок осуществляли на планшетном ридере при длине волны 492 нм. Толщину биомассы пленки, сформированной микроорганизмами, оценивали по методу [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Длительность лаг-фазы грибков в условиях нормального содержания лизоцима составляет 4 ч, после чего наступает продолжительная логарифмическая фаза, которая длится 20 ч и заканчивается максимальной стационарной фазой, когда уровень биомассы грибков достигает 0,474 усл. ед. оптической плотности, а скорость роста штамма – 0,081 усл. ед. оптической плотности в час. При повышении концентрации лизоцима лаг-фаза удлиняется и составляет 5 ч, фаза экспоненциального роста – 6 ч, после чего наступает фаза замедленного роста, продолжающаяся 1 ч. Последняя сменяется стационарной фазой, когда происходит гибель части популяции клеток. Эта фаза продолжается 10 ч. Количество C. albicans по истечении 24 ч культивирования составляет 0,468 усл. ед. оптической плотности, а скорость роста – 0,180 усл. ед. оптической плотности в час (p < 0,05). В целом скорость роста грибков в условиях повышенной концентрации лизоцима значительно превосходит скорость роста при его нормальном уровне. Однако по истечении 24 ч количество грибков в обоих штаммах имеет незначительные отличия. Можно предположить, что такое проявление активности лизоцима против дрожжеподобных грибков объясняется наличием в их клеточной стенке маннанопротеина и плотной капсулы.

Биопленкообразующая активность штаммов, культивируемых при повышенной концентрацией лизоцима, составила 0,616 усл. ед., а при нормальной – 0,114 усл. ед. (p < 0,05). В условиях повышенной концентрацией лизоцима происходит увеличение образования биопленки, что, вероятно, обусловлено усиленной пролиферацией C. albicans.

Показано, что лизоцим оказывает влияние на кинетику роста и его действие зависит от рН среды. При изучении активности фермента в среде с рН 5,0 установлено, что рост C. albicans резко снижается, т.е. можно предположить бактерицидное действие фермента. При рН среды 7,0 лизоцим также проявляет свою бактерицидную активность, однако в меньшей степени. Аналогичная зависимость активности лизоцима выявлена и при изучении биопленкообразования штаммами C. albicans.

ВЫВОДЫ

Таким образом, лизоцим меняет кинетику роста C. albicans, сокращая продолжительность экспоненциальной и удлиняя стационарную фазы роста. Кроме этого, повышенный уровень лизоцима способствует переходу грибков в планктонную форму роста, что необходимо учитывать при проведении лечения пациентов с кандидозом.

 

Рис. Кинетика роста Сandida albicans при различных концентрациях лизоцима

About the authors

Anatoliy P. Godovalov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: AGodovalov@gmail.com

PhD, leader researcher, CSIL, associate professor of Microbiology and Virology Department

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

Danila M. Pastukhov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: pastuhovdanilam@gmail.ru

student

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

References

Supplementary files