Содержание моноцитарного хемотаксического фактора в нормальной сперме и в образцах эякулята с пониженной фертильностью©

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Одной из задач «Концепции демографической политики Российской Федерации на период до 2025 года» является укрепление репродуктивного здоровья населения, укрепление института семьи [1, 8, 10]. Наиболее эффективное направление профилактики заболеваемости репродуктивной сферы у мужчин – выявление и устранение возможности воздействия на человека факторов окружающей и производственной среды, формирование здорового образа жизни [8, 9, 12]. Однако не менее важна и вторичная профилактика – раннее выявление и лечение начальных стадий бесплодия и предшествующих ему состояний [10, 12]. C этих позиций представляет интерес исследование индивидуальных белков семенной плазмы, выявление корреляционной связи их содержания с концентрацией, подвижностью и морфологическими особенностями сперматозоидов.

В настоящее время публикуются результаты определения белковых компонентов эякулята, в том числе интерлейкинов, ранее исследованных в сыворотке крови [2–4]. Одним из таких белков является моноцитарный хемотаксический фактор (MCP-1) – представитель суперсемейства небольших секретируемых протеинов – хемотаксических цитокинов (хемокинов) [5]. Функционально данная группа белков выступает в роли межклеточных мессенжеров, осуществляющих контроль миграции и активации лейкоцитов, вовлеченных в воспалительные реакции и иммунитет. Хемокины являются важными медиаторами во многих патологических процессах, таких как аллергическая реакция, хронические воспалительные и аутоиммунные заболевания, злокачественный рост и развитие гемопоэтических клеток.

В литературе используются различные синонимы и обозначения MCP-1: моноцитарный хемотаксический протеин-1, CC-хемокин, моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор, monocyte chemoattractant protein 1, CCL2 (C-C motif ligand 2), C-C motif chemokine ligand 2, MCAF, GDCF-2, HC11, HSMCR30, MCAF, MCP-1, MCP1, SCYA2, SMC-CF и др. Зрелый человеческий белок MCP-1 состоит из 76 аминокислот, экспрессируется преимущественно макрофагами в ответ на воздействие широкого спектра цитокинов (IL-6, TNF-a, IL-1b и др.). Но при стимуляции может продуцироваться и другими клетками: фибробластами, эндотелиальными клетками или клетками различных типов опухолей [5]. Данный белок широко изучается при различных нозологиях, в патогенезе которых отмечена инфильтрация мононуклеарных клеток.

Среди большого количества публикаций мы можем встретить работы, отражающие разнонаправленные и порой противоречивые результаты исследования MCP-1 в эякуляте мужчин с заболеваниями органов репродуктивного тракта [14, 15, 17, 18, 20, 23]. В большинстве исследований проводилось определение уровня MCP-1 лишь в одной биологической жидкости – эякуляте; и только в единственной публикации нами обнаружены результаты сравнительного исследования данного белка в сперме и сыворотке крови [17].

Таким образом, имеется дефицит печатных работ, посвященных сравнительному анализу содержания MCP-1 в эякуляте и сыворотке крови. Представляется интересным дальнейшее исследование указанного протеина в сперме, в том числе при мужском бесплодии.

Цель исследования – изучить содержание МСР-1 в сыворотке крови и семенной плазме здоровых мужчин и мужчин со снижением концентрации сперматозоидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Одномоментное обсервационное исследование типа «случай – контроль» выполнено с соблюдением принципов, изложенных в Хельсинкской декларации Всемирной организации здравоохранения (версия 2008 г.). Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

В исследование включены мужчины (n = 64) репродуктивного возраста, обратившиеся в медицинские учреждения г. Перми по поводу диагностики и лечения бесплодного брака. Все обследуемые предоставили письменное информированное согласие на использование остатков биоматериала для настоящего клинико-лабораторного исследования.

Критериями исключения являлась повышенная вязкость эякулята (более 5 мм по тесту отрыва нити) и признаки воспаления, в частности выявление лейкоцитов в препаратах эякулята более 1 в поле зрения [7].

Анализ эякулята выполняли в соответствии с рекомендациям Всемирной организации здравоохранения с использованием анализатора эякулята спермы MES SQA-V (MES, Израиль) [11, 24]. Микроскопический анализ препаратов эякулята осуществляли после окраски по Май-Грюнвальд – Гимза (Романовскому – Гимза) методом световой микроскопии на микроскопе MT8500 (Meiji Techno, Япония) при увеличении ×1000.

Все мужчины по результатам исследования эякулята были разделены на три группы (табл. 1). Основную группу (группа 1) составили 16 пациентов с отсутствием сперматозоидов (азооспермией). Группа сравнения (группа 2) включала 24 пациента с олигозооастеноспермией (концентрация сперматозоидов ниже 15 млн/мл). В контрольную группу (группу 3) вошли 24 здоровых мужчины с образцами эякулята, характеризовавшимися нормальными параметрами [24]. Группы были сопоставимы по возрасту.

 

Таблица 1

Характеристика групп обследованных

Характеристика пациентов	Основная группа (n = 16)	Группа сравнения (n = 24)	Контрольная группа (n = 24)
Возраст обследованных, годы	39,8 ± 4,3 38,5 (36,5; 45)   33–46	39,3 ± 6,7 38 (34; 44)   30–54	36,7 ± 6,6 37 (30;41,50000)   26–47
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	0 ± 0 0 (0; 0)   0	8,8 ± 3,2 9 (5,5; 11,5)   4,2–13,1	67,9 ± 32,1 57,5 (37,5; 100,5)   31,4–127,6
Содержание сперматозоидов в эякуляте, млн/эякулят	0 ± 0 0 (0; 0)   0	40,6 ± 19,2 39 (25;55,6)   4,9–19,3	319,9 ± 113 302,5 (258,5; 387,5)   81,5–523,8

Примечание. Здесь и в табл. 2 в числителе – среднее значение ± стандартное отклонение (M ± SD), в знаменателе – медиана и интерквартильный диапазон (Me и 25%-ный; 75%-ный квартиль), под дробью минимальные и максимальные результаты.

 

Исследовались образцы семенной плазмы и сыворотки крови, оставшиеся в клинико-диагностической лаборатории после выполнения всех запланированных исследований. Семенную плазму и сыворотку крови отделяли путем центрифугирования на центрифуге при 3000 об/мин в течение 15–20 минут. Аликвоты биологического материала переносили в пробирки типа Эппендорф и хранили до исследования при температуре –40 °С.

Концентрацию MCP-1 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов «MCP-1-ИФА-БЕСТ» (А 8784) (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Оптическую плотность проб измеряли на планшетном иммуноферментном анализаторе Stat Fax 4300^℗(Chromate) (Awarenes, USA). Правильность определения концентрации MCP-1 контролировали по результатам измерения внутреннего стандарта, значения которого составили 710,4 и 796,6 пг/мл при диапазоне допустимых значений 638–862 пг/мл.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 7 (StatSoftInc., США). Для каждого массива данных рассчитывали параметры описательной статистики: среднее арифметическое (М), стандартное отклонение (SD), а также медиану (Me) и интерквартильный диапазон (25–75-й перцентили). С помощью критерия Шапиро – Уилка оценивали распределение результатов внутри выборки и на основании полученных результатов для дальнейшей статистической обработки использовали методы непараметрической статистики. Для сравнения концентрации MCP-1 в парных образцах сыворотки крови и слюны использовали критерий Вилкоксона. Для сравнения нескольких независимых выборок применяли Н-критерий Краскелла – Уоллиса. Количественную оценку линейной связи между двумя случайными величинами осуществляли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R).

За максимально приемлемую вероятность ошибки первого рода (р) принимали величину уровня статистической значимости, равную 0,05 или меньше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У всех обследованных MCP-1 был обнаружен в сыворотке крови и во всех образцах семенной плазмы. В семенной плазме определялось достоверно более высокое содержание MCP-1 в сравнении с сывороткой крови (р = 0,000000). Его средняя концентрация в образцах неразведенной семенной плазмы составила 2242,8 ± 672,0 (медиана – 2295,3; интерквартильный диапазон – 1876,2; 2737,9 пг/мл), что в 18,9 раза превышало содержание MCP-1 в сыворотке крови – 118,8 ± 22,9 пг/мл (медиана – 116,8; интерквартильный диапазон – 100,8; 138,4 пг/мл) (р = 0,000000). Во всех исследованных неразбавленных образцах эякулята концентрация MCP-1 превысила 2000 пг/мл (рис. 1).

Различия между средними значениями уровня MCP-1 в семенной плазме и сыворотке крови в основной группе составили 13,7 раза (р = 0,000438), в группе сравнения – 15,98 раза (р = 0,000018), а в контрольной группе – 18,82 раза (р = 0,000018) (табл. 1).

При сравнении концентрации MCP-1 между группами не обнаружено достоверных различий ни для сыворотки крови (р = 0,2696), ни для семенной плазмы (р = 0,3533). Результаты исследований и попарных сравнений между группами представлены в табл. 2.

Анализ корреляционных зависимостей между содержанием МСР-1 в сыворотке крови и семенной плазме не выявил достоверных различий ни в целом для всех образцов (R = 0,038668), ни внутри групп (см. табл. 2). График линейной регрессии описывался уравнением (рис. 2)

МСР-1 (семенная плазма), пг/мл = 1913,0 + + 2,7756 · МСР-1 (сыворотка крови), пг/мл.

 

Рис. 1. Содержание моноцитарного хемотаксического фактора в сыворотке крови (с) и семенной плазме эякулята (э) обследованных: 1 – основная группа; 2 – группа сравнения; 3 – контрольная группа

 

Таблица 2

Концентрация моноцитарного хемотаксического фактора, пг/мл, в сыворотке крови и семенной плазме обследованных

Параметр	Основная группа (n = 16)	Группа сравнения (n = 24)	Контрольная группа (n = 24)	H-критерий Краскелла – Уоллиса
Сыворотка крови	126,0 ± 23,9 131,9 (101,6; 149,4)   92,5–154,3	113,4 ± 20,2 108,9 (102,0; 130,5)   80,5–152,9	119,5 ± 24,1 122,6 (96,4; 139,9)   80,3–152,2	H = 2,621755 (р = 0,2696) p1–2 = 0,316322 р1–3 = 0,969370 p2–3 = 1,000000
Семенная плазма	2478,1 ± 267,6 2482,9 (2239,9; 2689,8)   2068,0–2869,5	2087,7 ± 789,7 2126,6 (1270,2; 2780,1)   897,9–3228,3	2241,1 ± 709,4 2232,6 (1813,4; 2825,8)   834,4–3213,5	H = 2,080769 (р = 0,3533) p1–2 = 0,447721 р1–3 = 1,000000 p2–3 = 1,000000
Критерий Спирмена	R = 0,297059	R = 0,056522	R = –0,017391	–
Критерий Вилкоксона	р = 0,000438	р = 0,000018	р = 0,000018	–

 

Рис. 2. Содержание моноцитарного хемотаксического фактора (МСР-1) в сыворотке крови и семенной плазме обследованных

 

Выявляемые нами закономерности согласуются с результатами данных литературы [17]. МСР-1, обнаруживаемый в биологических жидкостях человеческого организма, может иметь различное происхождение. В ряд биологических жидкостей указанный протеин может поступать из сыворотки крови в процессе экссудации. Однако полученные результаты не позволяют считать данный механизм основным источником МСР-1 семенной плазмы. Вероятно, в эякулят данный белок активно продуцируется органами мужской репродуктивной системы, а не проникает из крови пассивно в результате диффузии по градиенту концентрации. На это указывает намного более высокий, в сравнении с кровью, уровень МСР-1 в семенной плазме. Кроме того, данный факт подтверждается отсутствием корреляции содержания этого белка между семенной плазмой и сывороткой крови.

Известно, что хемокины вызывают хемотаксис чувствительных к ним клеток. Одна группа хемокинов (например интерлейкин-8) является провоспалительными цитокинами и стимулирует миграцию иммунных клеток к месту инфицирования. Другая группа функционирует в нормальном гомеостазе и контролирует миграцию клеток в процессе жизнедеятельности и развития тканей организма в норме [5].

Как хемотаксический агент для макрофагов и дендритных клеток MCP-1 в повышенной концентрации во влагалище и в шейке матки заставляет мигрировать эти клетки в слизистые, тем самым обеспечивая первую линию защиты от различных патогенных факторов [21, 22]. Попадает указанный белок туда, в частности, в составе спермы. Известно, что различные компоненты эякулята способны влиять на местный иммунный ответ в различных отделах урогенитального тракта женщин [6, 16, 19, 22]. По нашему мнению, МСР-1 эякулята принимает участие в формировании местного иммунитета в женской половой системе, в том числе в преддверии оплодотворения. Вероятным местом, где вырабатывается МСР-1 в мужском репродуктивном тракте, может являться либо предстательная железа, либо семенные пузырьки – органы, секреты которых составляют значительную долю объема эякулята.

ВЫВОДЫ

1. Семенная плазма мужчин характеризуется необыкновенно высоким содержанием MCP-1, превосходящим более чем в 10 раз концентрацию этого белка в сыворотке крови.
2. Необычно высокий уровень MCP-1 в семенной плазме следует учитывать при планировании исследований и при необходимости выполнять предварительное разведение семенной плазмы.
3. Высокая концентрация MCP-1 в семенной плазме и отсутствие ее зависимости от концентрации этого белка в сыворотке крови указывает на местную продукцию указанного протеина в семенную плазму органами мужского репродуктивного тракта.
4. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения конкретной локализации мест выработки данного белка в органах, участвующих в продукции эякулята, а также изучения его вероятной роли в процессах репродукции в мужском и женском организмах.

Об авторах

Дмитрий Юрьевич Соснин

Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера

Автор, ответственный за переписку.
Email: sosnin_dm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1232-8826
SPIN-код: 4204-6796

доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ФДПО

Россия, 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская 26

Константин Романович Галькович

ООО «МедГарант»

Email: kr20211@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9039-7117
SPIN-код: 3576-0522

кандидат медицинских наук, врач-уролог

Россия, г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы