Monocyte chemotactic factor content in normal sperm and in samples of ejaculate with diminished fertility

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Одной из задач «Концепции демографической политики Российской Федерации на период до 2025 года» является укрепление репродуктивного здоровья населения, укрепление института семьи [1, 8, 10]. Наиболее эффективное направление профилактики заболеваемости репродуктивной сферы у мужчин – выявление и устранение возможности воздействия на человека факторов окружающей и производственной среды, формирование здорового образа жизни [8, 9, 12]. Однако не менее важна и вторичная профилактика – раннее выявление и лечение начальных стадий бесплодия и предшествующих ему состояний [10, 12]. C этих позиций представляет интерес исследование индивидуальных белков семенной плазмы, выявление корреляционной связи их содержания с концентрацией, подвижностью и морфологическими особенностями сперматозоидов.

В настоящее время публикуются результаты определения белковых компонентов эякулята, в том числе интерлейкинов, ранее исследованных в сыворотке крови [2–4]. Одним из таких белков является моноцитарный хемотаксический фактор (MCP-1) – представитель суперсемейства небольших секретируемых протеинов – хемотаксических цитокинов (хемокинов) [5]. Функционально данная группа белков выступает в роли межклеточных мессенжеров, осуществляющих контроль миграции и активации лейкоцитов, вовлеченных в воспалительные реакции и иммунитет. Хемокины являются важными медиаторами во многих патологических процессах, таких как аллергическая реакция, хронические воспалительные и аутоиммунные заболевания, злокачественный рост и развитие гемопоэтических клеток.

В литературе используются различные синонимы и обозначения MCP-1: моноцитарный хемотаксический протеин-1, CC-хемокин, моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор, monocyte chemoattractant protein 1, CCL2 (C-C motif ligand 2), C-C motif chemokine ligand 2, MCAF, GDCF-2, HC11, HSMCR30, MCAF, MCP-1, MCP1, SCYA2, SMC-CF и др. Зрелый человеческий белок MCP-1 состоит из 76 аминокислот, экспрессируется преимущественно макрофагами в ответ на воздействие широкого спектра цитокинов (IL-6, TNF-a, IL-1b и др.). Но при стимуляции может продуцироваться и другими клетками: фибробластами, эндотелиальными клетками или клетками различных типов опухолей [5]. Данный белок широко изучается при различных нозологиях, в патогенезе которых отмечена инфильтрация мононуклеарных клеток.

Среди большого количества публикаций мы можем встретить работы, отражающие разнонаправленные и порой противоречивые результаты исследования MCP-1 в эякуляте мужчин с заболеваниями органов репродуктивного тракта [14, 15, 17, 18, 20, 23]. В большинстве исследований проводилось определение уровня MCP-1 лишь в одной биологической жидкости – эякуляте; и только в единственной публикации нами обнаружены результаты сравнительного исследования данного белка в сперме и сыворотке крови [17].

Таким образом, имеется дефицит печатных работ, посвященных сравнительному анализу содержания MCP-1 в эякуляте и сыворотке крови. Представляется интересным дальнейшее исследование указанного протеина в сперме, в том числе при мужском бесплодии.

Цель исследования – изучить содержание МСР-1 в сыворотке крови и семенной плазме здоровых мужчин и мужчин со снижением концентрации сперматозоидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Одномоментное обсервационное исследование типа «случай – контроль» выполнено с соблюдением принципов, изложенных в Хельсинкской декларации Всемирной организации здравоохранения (версия 2008 г.). Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

В исследование включены мужчины (n = 64) репродуктивного возраста, обратившиеся в медицинские учреждения г. Перми по поводу диагностики и лечения бесплодного брака. Все обследуемые предоставили письменное информированное согласие на использование остатков биоматериала для настоящего клинико-лабораторного исследования.

Критериями исключения являлась повышенная вязкость эякулята (более 5 мм по тесту отрыва нити) и признаки воспаления, в частности выявление лейкоцитов в препаратах эякулята более 1 в поле зрения [7].

Анализ эякулята выполняли в соответствии с рекомендациям Всемирной организации здравоохранения с использованием анализатора эякулята спермы MES SQA-V (MES, Израиль) [11, 24]. Микроскопический анализ препаратов эякулята осуществляли после окраски по Май-Грюнвальд – Гимза (Романовскому – Гимза) методом световой микроскопии на микроскопе MT8500 (Meiji Techno, Япония) при увеличении ×1000.

Все мужчины по результатам исследования эякулята были разделены на три группы (табл. 1). Основную группу (группа 1) составили 16 пациентов с отсутствием сперматозоидов (азооспермией). Группа сравнения (группа 2) включала 24 пациента с олигозооастеноспермией (концентрация сперматозоидов ниже 15 млн/мл). В контрольную группу (группу 3) вошли 24 здоровых мужчины с образцами эякулята, характеризовавшимися нормальными параметрами [24]. Группы были сопоставимы по возрасту.

 

Таблица 1

Характеристика групп обследованных

Характеристика пациентов	Основная группа (n = 16)	Группа сравнения (n = 24)	Контрольная группа (n = 24)
Возраст обследованных, годы	39,8 ± 4,3 38,5 (36,5; 45)   33–46	39,3 ± 6,7 38 (34; 44)   30–54	36,7 ± 6,6 37 (30;41,50000)   26–47
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	0 ± 0 0 (0; 0)   0	8,8 ± 3,2 9 (5,5; 11,5)   4,2–13,1	67,9 ± 32,1 57,5 (37,5; 100,5)   31,4–127,6
Содержание сперматозоидов в эякуляте, млн/эякулят	0 ± 0 0 (0; 0)   0	40,6 ± 19,2 39 (25;55,6)   4,9–19,3	319,9 ± 113 302,5 (258,5; 387,5)   81,5–523,8

Примечание. Здесь и в табл. 2 в числителе – среднее значение ± стандартное отклонение (M ± SD), в знаменателе – медиана и интерквартильный диапазон (Me и 25%-ный; 75%-ный квартиль), под дробью минимальные и максимальные результаты.

 

Исследовались образцы семенной плазмы и сыворотки крови, оставшиеся в клинико-диагностической лаборатории после выполнения всех запланированных исследований. Семенную плазму и сыворотку крови отделяли путем центрифугирования на центрифуге при 3000 об/мин в течение 15–20 минут. Аликвоты биологического материала переносили в пробирки типа Эппендорф и хранили до исследования при температуре –40 °С.

Концентрацию MCP-1 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов «MCP-1-ИФА-БЕСТ» (А 8784) (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Оптическую плотность проб измеряли на планшетном иммуноферментном анализаторе Stat Fax 4300^℗(Chromate) (Awarenes, USA). Правильность определения концентрации MCP-1 контролировали по результатам измерения внутреннего стандарта, значения которого составили 710,4 и 796,6 пг/мл при диапазоне допустимых значений 638–862 пг/мл.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 7 (StatSoftInc., США). Для каждого массива данных рассчитывали параметры описательной статистики: среднее арифметическое (М), стандартное отклонение (SD), а также медиану (Me) и интерквартильный диапазон (25–75-й перцентили). С помощью критерия Шапиро – Уилка оценивали распределение результатов внутри выборки и на основании полученных результатов для дальнейшей статистической обработки использовали методы непараметрической статистики. Для сравнения концентрации MCP-1 в парных образцах сыворотки крови и слюны использовали критерий Вилкоксона. Для сравнения нескольких независимых выборок применяли Н-критерий Краскелла – Уоллиса. Количественную оценку линейной связи между двумя случайными величинами осуществляли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R).

За максимально приемлемую вероятность ошибки первого рода (р) принимали величину уровня статистической значимости, равную 0,05 или меньше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У всех обследованных MCP-1 был обнаружен в сыворотке крови и во всех образцах семенной плазмы. В семенной плазме определялось достоверно более высокое содержание MCP-1 в сравнении с сывороткой крови (р = 0,000000). Его средняя концентрация в образцах неразведенной семенной плазмы составила 2242,8 ± 672,0 (медиана – 2295,3; интерквартильный диапазон – 1876,2; 2737,9 пг/мл), что в 18,9 раза превышало содержание MCP-1 в сыворотке крови – 118,8 ± 22,9 пг/мл (медиана – 116,8; интерквартильный диапазон – 100,8; 138,4 пг/мл) (р = 0,000000). Во всех исследованных неразбавленных образцах эякулята концентрация MCP-1 превысила 2000 пг/мл (рис. 1).

Различия между средними значениями уровня MCP-1 в семенной плазме и сыворотке крови в основной группе составили 13,7 раза (р = 0,000438), в группе сравнения – 15,98 раза (р = 0,000018), а в контрольной группе – 18,82 раза (р = 0,000018) (табл. 1).

При сравнении концентрации MCP-1 между группами не обнаружено достоверных различий ни для сыворотки крови (р = 0,2696), ни для семенной плазмы (р = 0,3533). Результаты исследований и попарных сравнений между группами представлены в табл. 2.

Анализ корреляционных зависимостей между содержанием МСР-1 в сыворотке крови и семенной плазме не выявил достоверных различий ни в целом для всех образцов (R = 0,038668), ни внутри групп (см. табл. 2). График линейной регрессии описывался уравнением (рис. 2)

МСР-1 (семенная плазма), пг/мл = 1913,0 + + 2,7756 · МСР-1 (сыворотка крови), пг/мл.

 

Рис. 1. Содержание моноцитарного хемотаксического фактора в сыворотке крови (с) и семенной плазме эякулята (э) обследованных: 1 – основная группа; 2 – группа сравнения; 3 – контрольная группа

 

Таблица 2

Концентрация моноцитарного хемотаксического фактора, пг/мл, в сыворотке крови и семенной плазме обследованных

Параметр	Основная группа (n = 16)	Группа сравнения (n = 24)	Контрольная группа (n = 24)	H-критерий Краскелла – Уоллиса
Сыворотка крови	126,0 ± 23,9 131,9 (101,6; 149,4)   92,5–154,3	113,4 ± 20,2 108,9 (102,0; 130,5)   80,5–152,9	119,5 ± 24,1 122,6 (96,4; 139,9)   80,3–152,2	H = 2,621755 (р = 0,2696) p1–2 = 0,316322 р1–3 = 0,969370 p2–3 = 1,000000
Семенная плазма	2478,1 ± 267,6 2482,9 (2239,9; 2689,8)   2068,0–2869,5	2087,7 ± 789,7 2126,6 (1270,2; 2780,1)   897,9–3228,3	2241,1 ± 709,4 2232,6 (1813,4; 2825,8)   834,4–3213,5	H = 2,080769 (р = 0,3533) p1–2 = 0,447721 р1–3 = 1,000000 p2–3 = 1,000000
Критерий Спирмена	R = 0,297059	R = 0,056522	R = –0,017391	–
Критерий Вилкоксона	р = 0,000438	р = 0,000018	р = 0,000018	–

 

Рис. 2. Содержание моноцитарного хемотаксического фактора (МСР-1) в сыворотке крови и семенной плазме обследованных

 

Выявляемые нами закономерности согласуются с результатами данных литературы [17]. МСР-1, обнаруживаемый в биологических жидкостях человеческого организма, может иметь различное происхождение. В ряд биологических жидкостей указанный протеин может поступать из сыворотки крови в процессе экссудации. Однако полученные результаты не позволяют считать данный механизм основным источником МСР-1 семенной плазмы. Вероятно, в эякулят данный белок активно продуцируется органами мужской репродуктивной системы, а не проникает из крови пассивно в результате диффузии по градиенту концентрации. На это указывает намного более высокий, в сравнении с кровью, уровень МСР-1 в семенной плазме. Кроме того, данный факт подтверждается отсутствием корреляции содержания этого белка между семенной плазмой и сывороткой крови.

Известно, что хемокины вызывают хемотаксис чувствительных к ним клеток. Одна группа хемокинов (например интерлейкин-8) является провоспалительными цитокинами и стимулирует миграцию иммунных клеток к месту инфицирования. Другая группа функционирует в нормальном гомеостазе и контролирует миграцию клеток в процессе жизнедеятельности и развития тканей организма в норме [5].

Как хемотаксический агент для макрофагов и дендритных клеток MCP-1 в повышенной концентрации во влагалище и в шейке матки заставляет мигрировать эти клетки в слизистые, тем самым обеспечивая первую линию защиты от различных патогенных факторов [21, 22]. Попадает указанный белок туда, в частности, в составе спермы. Известно, что различные компоненты эякулята способны влиять на местный иммунный ответ в различных отделах урогенитального тракта женщин [6, 16, 19, 22]. По нашему мнению, МСР-1 эякулята принимает участие в формировании местного иммунитета в женской половой системе, в том числе в преддверии оплодотворения. Вероятным местом, где вырабатывается МСР-1 в мужском репродуктивном тракте, может являться либо предстательная железа, либо семенные пузырьки – органы, секреты которых составляют значительную долю объема эякулята.

ВЫВОДЫ

1. Семенная плазма мужчин характеризуется необыкновенно высоким содержанием MCP-1, превосходящим более чем в 10 раз концентрацию этого белка в сыворотке крови.
2. Необычно высокий уровень MCP-1 в семенной плазме следует учитывать при планировании исследований и при необходимости выполнять предварительное разведение семенной плазмы.
3. Высокая концентрация MCP-1 в семенной плазме и отсутствие ее зависимости от концентрации этого белка в сыворотке крови указывает на местную продукцию указанного протеина в семенную плазму органами мужского репродуктивного тракта.
4. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения конкретной локализации мест выработки данного белка в органах, участвующих в продукции эякулята, а также изучения его вероятной роли в процессах репродукции в мужском и женском организмах.

About the authors

Dmitriy Yu. Sosnin

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: sosnin_dm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1232-8826
SPIN-code: 4204-6796

Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics 

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

Konstantin R. Galkovich

Ltd Company “MedGarant”

Email: kr20211@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9039-7117
SPIN-code: 3576-0522

Candidate of Medical Sciences, urologist

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files