Influence of congenital heart disease-caused hypoxia on intrathymic development of t-lymphocytes in children of first year of life

Full Text

Введение

Врожденные пороки сердца (ВПС) входят в группу самых частых аномалий развития у детей и составляют 25 % всех врожденных аномалий развития [1, 2]. При естественном течении ВПС к концу первого года жизни умирает более 70 % детей [3]. В литературе последних лет представлены сведения, что дети с ВПС подвержены различным заболеваниям из-за имеющегося у них иммунного дисбаланса [4–6]. В периферической крови таких детей снижен уровень CD4+ и CD8+ лимфоцитов [10], изменен субпопуляционный состав Т-лимфоцитов, меняется баланс провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [4]. По данным М.Ф. Зиньковского [2], в подобных случаях нарушение иммунных процессов проявляется угнетением всех звеньев иммунитета, что может быть не только причиной острых, рецидивирующих форм инфекций, но и этиологическим фактором в развитии тяжелых послеоперационных осложнений. Установлено, что степень иммуносупрессии в послеоперационном периоде сильнее выражена у детей с врожденными пороками, вызывающими цианоз слизистых и кожных покровов (синий тип), сочетающихся с выраженным нарушением гемодинамики и кислородным дефицитом, тогда как у детей с ВПС, не вызывающими цианоза (белый тип), эти изменения менее выражены [11]. Важным утяжеляющим фактором для организма является то, что оперативное лечение ВПС часто сопровождается удалением тимуса, связанным с доступом к сердцу, и является неотъемлемой частью общепринятой мировой практики.

В настоящее время основная часть исследований посвящена оценке послеоперационного состояния иммунной системы детей с ВПС после проведенной у них тимэктомии [6–8, 12]. Однако вопрос о состоянии тимуса как первичного органа иммуногенеза и обеспечение им развивающегося организма Т-лимфоцитами в условиях циркуляторной гипоксии на сегодня остается нерешенным.

Цель исследования – изучение влияния гипоксии, вызванной врожденным пороком сердца, на внутритимическое развитие Т-лимфоцитов и обеспечение Т-клеточным ресурсом детей с патологией сердца разной степени сложности.

Материалы и методы исследования

Исследованы биоптаты тимуса 126 детей в возрасте от одного до 11 месяцев. Тимэктомия проводилась при сердечно-сосудистых операциях у детей до года с целью коррекции врожденных пороков сердца в соответствии с существующей хирургической практикой Федерального краевого центра сердечно-сосудистой хирургии г. Перми. Исследования были проведены согласно Хельсинкской декларации ВМА 2000 г. и соответствуют протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г.; обязательным критерием включения являлось наличие добровольного согласия со стороны законных представителей несовершеннолетних. Согласно клиническому признаку (наличие или отсутствие цианоза слизистых и кожных покровов) выделены две группы ВПС: 1-я (n = 62) – белые типы (без цианоза); 2-я группа (n = 64) – синие типы (с цианозом). Группу сравнения составили тимусы случайно погибших клинически здоровых детей (n = 11) в возрасте до года.

Исследовали также периферическую кровь (n = 31). У детей с ВПС (n = 21) кровь забирали из локтевой вены перед тимэктомией в объеме 2,5 мл. Группу сравнения составили здоровые дети (n = 10) в возрасте до 1,2 г.

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах, которые наносили на адгезивные стекла, обработанные полилизином (Thermo, Великобритания). Иммуногистохимические реакции проводили аппаратным способом с использованием иммуногистохимических автостейнеров Autostainer-360 (Thermo, Великобритания). Для визуaлизaции рeзультaтoв применяли системы дeтeкции Ultra Visiоn ONE Dеtесtiоn Systеm HRP Pоlymеr. Препараты инкубировали с хромогеном DАB Plus Substrаtе Systеm и дoкрашивали гематoксилинoм Майера с заключением в био-маунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (Labvision, США).

Для определения качественного и количественного состава тимоцитов использовали моноклональные антитела (Dako, США) к: 1) CD3 – для идентификации зрелых Т-лимфоцитов; 2) Ki-67 – для клеток, делящихся митозом и находящихся в разных фазах клеточного цикла (G1-, S- и G2). Численную плотность (Ni) позитивно окрашенных CD3-тимоцитов рассчитывали по формуле:

Ni = (Pi/Pt)100 (%),

где Pi – количество точек тестовой системы, попавших на позитивно окрашенные CD3-лимфоциты, Pt – общее число точек закрытой тестовой системы (81). При оценке экспрессии Ki-67 рассчитывали индекс пролиферации (IKi) по формуле:

IKi = (n+/N)100 (%),

где n – число меченых ядер, N – общее число ядер в поле зрения микроскопа. Подсчеты проводили в 10 полях зрения каждого среза.

Фенотипическое созревание тимоцитов оценивалось путем выделения клеток из фрагментов тимусов пипетированием. Полученная клеточная суспензия на 85 % и более состояла из CD4+CD8+-тимоцитов, что верифицировалось методом проточной цитометрии. Выделенные тимоциты трижды отмывали в забуференном физиологическом растворе с рН = 7,4 и затем инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете (1∙106 кл в пробе) в полной питательной среде в течение 72 ч при 37 °С в условиях 5%-ного СО2. Фенотипическое созревание тимоцитов оценивали по изменению коэкспрессии молекул CD4/CD8 и переходу незрелых CD4+CD8+-тимоцитов в более зрелые CD4+CD8-/CD4-CD8+-клетки. Для этого в гейте тимоцитов подсчитывали число CD4+CD8+; CD4+CD8-; CD4-CD8+; CD4-CD8--клеток методом проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител (PE Аnti-Human CD4, OKT4; PC5 Аnti-Human CD8, eBioscience, США). Детекция результатов производилась методом иммунофлюоресценции на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции окна использовали соответствующие изотипические контроли. Лимфоцитарный гейт выставляли на основе комбинации прямого и бокового светорассеивания и размера клеток. При учете результатов подсчитывали более 100 000 клеток.

Определение Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК). Выделение ДНК проводили из 1 мл цельной крови с использованием набора реагентов «KR-012» (OMNIX, Россия) согласно инструкции производителя. Общую концентрацию ДНК и степень ее контаминации белком определяли спектрофотометрически (UVmini 1240, Shimadzu, Япония) общепринятым методом [13]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени осуществляли с использованием коммерческой реакционной смеси («Синтол», Россия), пары праймеров 5'-CACATCCCTTTCAACCATGCT и 3'-GCCAGCTGCAGGGTTTAGG (10 пкмоль/мкл каждого) и флюоресцентного зонда TCR2: FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-BHQ1. В качестве референсной последовательности был использован β-актин (коммерческий набор β-actin control reagents, Applied Biosystems, США). Реакцию осуществляли на термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США) по программе: 95оС – 180 с (1-й цикл); 61оС – 20 с, 70оС – 10 с, 95оС – 15 с (50 циклов). Амплификация целевого и референсного генов проводилась раздельно. Для расчета количества TРЭК применяли математический метод 2-∆∆Ct [14].

Результаты выражали в виде средней арифметической и ее среднего отклонения (М ± m). Достоверность межу группами оценивали по t-критерию Стьюдента для непарных и парных данных или непараметрического U-критерия Манна – Уитни в зависимости от нормальности распределения данных. Различия считались значимыми при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

Пролиферация тимоцитов – неотъемлемый процесс, связанный с внутритимическим созреванием Т-лимфоцитов. С помощью ядерного биомаркера Ki-67 изучена интенсивность пролиферации тимоцитов. Маркер Ki-67 реагирует с клетками, находящимися в G1, S, M, G2-стадиях клеточного цикла. Если клетка не пролиферирует, такого взаимодействия не происходит. При изучении пролиферативной активности тимоцитов приняты во внимание зональные особенности коркового вещества. Первый этап пролиферации тимоцитов проходит в кортикомедуллярной зоне, там, куда первоначально мигрируют предшественники Т-лимфоцитов из красного костного мозга. В дальнейшем тимоциты последовательно поступают в субкапсулярную и кортикальную зону.

В группе контроля положительная экспрессия Ki-67 интенсивно выявляется в тимоцитах в пределах всей дольки в виде окрашенного в коричневый цвет ядерного субстрата (рис. 1, а).

В группе с синим типом ВПС маркер пролиферации Ki-67 регистрировался во всех зонах коркового вещества, достоверно отличаясь от показателя контроля на протяжении всех сроков исследования. В кортикомедуллярной зоне пролиферация тимоцитов к первому месяцу, в сравнении с контрольной группой, снижается на 11 % (р ˂ 0,001). В последующем индекс пролиферации (IKi-67) в 6 и в 11 месяцев становится ниже контрольных данных в 2,6 раза – на 28 % (р ˂ 0,001).

В субкапсулярной зоне уже в первый месяц IKi-67 выявляется на 18 % меньше, чем в контроле (р ˂ 0,001). В течение всего года экспрессия маркера Ki-67 в клетках продолжает снижаться; через 6 месяцев интенсивность пролиферации ниже на 25 %, а к 11-му месяцу – до 33,5 %, т.е. более чем в три раза по отношению к данным контрольной группы (р ˂ 0,001).

В участках глубокой коры IKi-67 на протяжении всех сроков наблюдений также существенно снижается и к 11-му месяцу становится меньше на 38 % по сравнению с данными группы контроля (р ˂ 0,001). В этот возрастной период в пределах всего коркового вещества позитивно окрашенные тимоциты располагаются диффузно, находясь в окружении клеток, не участвующих в пролиферации (рис. 1, б).

В группе с белым типом ВПС в первый месяц в кортикомедуллярной зоне IKi-67 не имеет достоверных отличий от контрольных данных. С 6-го месяца интенсивность пролиферации снижается, а к 11-му месяцу уступает в среднем на 17 % группе контроля (р ˂ 0,001).

 

Рис. 1. Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 в тимоцитах коркового вещества дольки тимуса: а – группа контроля; б – синий порок ВПС. Ув. ´1000

 

Из кортикомедуллярной зоны тимоциты поступают в субкапсуллярную, где начинается следующий этап их пролиферации. В этой части коркового вещества в течение года (1 – 6 – 11 месяцев) идет медленное снижение накопления маркера Ki-67. Если в первый месяц IKi-67 регистрируется на 7 % ниже данных контроля (р ˂ 0,001), то к 11-му месяцу пролиферация снижается уже в 1,5 раза, и на 24 % регистрируется ниже по отношению к первому месяцу (табл. 1).

 

Таблица 1

Индекс пролиферации (IKi-67) тимоцитов в зонах дольки тимуса (%)

Зона дольки тимуса	Контроль	Тип ВПС	Срок наблюдения, мес.
			1	6	11
Субкапсулярная	97,84 ± 5,47	С	77,16 ± 8,06*	69,84 ± 5,90*	62,40 ± 10,04*
		Б	87,52 ± 3,46*	74,40 ± 3,51*	66,48 ± 13,04*
Глубокая кора	78,68 ± 5,43	С	69,64 ± 2,98*	60,54 ± 6,85*	48,71 ± 3,47*
		Б	72,61 ± 13,33	68,43 ± 2,74*	65,61 ± 2,16*
Кортикомедуллярная	86,56 ± 3,91	С	74,68 ± 4,07*	60,88 ± 9,33*	61,28 ± 12,63*
		Б	80,64 ± 10,27	71,92 ± 3,46*	67,20 ± 9,83*

Примечание: * – значимые различия (p ˂ 0,05) между группами по отношению к контролю (M ± m). С – синий тип ВПС; Б – белый тип ВПС.

 

Из субкапсулярной зоны тимоциты перемещаются в сторону мозгового вещества, проходя через основную часть коры. Находясь в пределах глубокой коры, клетки постоянно пролиферируют. К 11-му месяцу экспрессия Ki-67, выявляемая в ядрах, обнаруживается в диффузно расположенных тимоцитах. В этой зоне в течение года регистрируется уменьшение числа клеток, вступивших в пролиферацию. Так, к 11 месяцам разница с контролем увеличивается в два раза – до 17 % (р ˂ 0,001).

В корковом веществе на этапах антигеннезависимой дифференцировки тимоциты вступают в контакт с ретикулоэпителиоцитами, пролиферируют и приобретают основные рецепторы (TCR-CD3+). В каждой зоне этому способствуют специфические стимулирующие факторы, выделяемые клетками микроокружения.

Интенсивность тимопоэза in vivo оценивалась на основе экспрессии маркера CD3. При сердечных пороках численная плотность зрелых тимоцитов, несущих рецепторный комплекс CD3 в корковом веществе, зависит от типа ВПС и на протяжении всех сроков исследования определялась ниже, чем в контроле.

В группе с белым типом ВПС число CD3-позитивных тимоцитов в первый месяц (в поле зрения среза) регистрировалось на 25 % ниже контрольных данных (табл. 2). В последующем, к 6-му месяцу, число CD3+ тимоцитов снижается еще на 13 % и остается на этом уровне до 11-го месяца жизни (р ˂ 0,001).

 

Таблица 2

Количество тимоцитов в поле зрения тимуса

Зона коры дольки	Контроль	Тип ВПС	Срок наблюдения, мес.
			1	6	11
Субкапсулярная	331,62 ± 11,87	С	293,80 ± 25,49	247,75 ± 12,82*	233,75 ± 32,29*
		Б	334, 42 ± 25,72	303,76 ± 5,33*	291,50 ± 15,03
Глубокая кора	472,31 ± 10,68	С	427,30 ± 14,03*	386,18 ± 26,99*	373,98 ± 14,89*
		Б	444,05 ± 5,41*	420,79 ± 5,91*	411,13 ± 25,33*

Примечание: *– значимые различия (p ˂ 0,05) между группами по отношению к контролю (M ± m). С – синий тип ВПС; Б – белый тип ВПС.

 

Синий тип ВПС ведет к более существенному снижению тимопоэза. Экспрессия CD3 в корковом веществе уже в первый месяц становится меньше на 35 % (р ˂ 0,001). В последующем снижение продолжается, и к 11-му месяцу интенсивность тимопоэза определяется уже на 47 % меньше, чем в группе контроля (см. табл. 2). В пределах коркового вещества CD3+-тимоциты располагаются диффузно.

Результаты исследования показывают, что интенсивность пролиферации тимоцитов определяет их последующую дифференцировку. На наш взгляд, это связано с состоянием ретикулоэпителиоцитов коркового вещества, о чем говорилось нами ранее [9]. Ретикулоэпителиоциты, как известно, выполняют функцию тканевого каркаса и являются источниками сигналов для развивающихся тимоцитов. Установленные ранее морфологические, ультраскопические и иммуногистохимические изменения ретикулоэпителиоцитов при действии гипоксии лишают тимоциты возможности для их полноценного функционального микроокружения. Степень выраженности гипоксии в значительной мере влияет на интенсивность как пролиферации, так и образования CD3+-рецепторов. При синем типе ВПС указанные процессы в корковом веществе угнетены сильнее, чем при белом типе порока. Все это в конечном счете влияет на качество развития тимоцитов и, как результат, на формирование Т-клеточного ресурса организма.

Качество фенотипического созревания тимоцитов оценивали по изменению коэкспрессии молекул CD4/CD8 и переходу незрелых CD4+ CD8+-тимоцитов в более зрелые CD4+ CD8- /CD4- CD8+-клетки.

Установлено, что у детей с синим типом ВПС достоверно выше содержание незрелых дубльпозитивных тимоцитов (CD4+CD8+) при сравнении с детьми с белым типом ВПС (табл. 3). Таким образом, можно полагать, что более выраженная гипоксия препятствует фенотипическому созреванию тимоцитов, что также может являться причиной дисфункциональных нарушений.

 

Таблица 3

Фенотипические изменения в культуре тимоцитов в группах с белым и синим типом ВПС

Исследуемая группа	CD4+CD8+- тимоциты, %	CD4+CD8- - тимоциты, %	CD4-CD8+- тимоциты, %	CD4-CD8- - тимоциты, %
Белый тип ВПС	84,94 ± 2,34	9,21 ± 3,61	4,26 ± 1,07	1,58 ± 0,52
Синий тип ВПС	89,19 ± 2,39*	7,79 ± 0,21	2,18 ± 0,46	0,87 ± 0,25

Примечание: * – различия достоверны (p < 0,05) по непарному t-критерию Стьюдента по отношению к белому типу ВПС.

 

Одним из основных показателей функциональной активности тимуса является его способность продуцировать Т-лимфоциты, критерием этого будет присутствие в периферической крови недавних тимусных мигрантов, содержащих Т-рецепторные эксцизионные кольца (ТРЭК). TРЭК содержатся в CD3+-тимоцитах и рассматриваются как маркеры Т-клеток, недавно мигрировавших из тимуса на периферию (недавние тимусные эмигранты). TРЭК – это структуры стабильные, они не делятся и дочерним клеткам не передаются. В ходе пролиферации происходит постепенная их элиминация. В связи с этим уровень TРЭК рассматривают как показатель функциональной активности тимуса, т.е. его способности продуцировать Т-лимфоциты [15]. Выявление ТРЭК с помощью ПЦР в реальном времени сейчас является наиболее надежным методом количественной оценки содержания недавних тимусных эмигрантов.

Результаты исследования показали, что количество TРЭК в периферической крови здоровых детей составляет 1,07038 [0, 96680; 1, 46902]. В общей группе больных детей с ВПС, независимо от степени сложности врожденных пороков сердца, в крови определяется достоверно низкое количество TРЭК в сравнении с группой здоровых детей, что отражает общее снижение тимической активности – 0,71097 [0, 38524; 0, 85681] (рис. 2). Сравнительная оценка содержания ТРЭК при разных пороках, обусловленных степенью выраженности гипоксии, показала, что наиболее низкий уровень количества ТРЭК у детей определяется при синих типах ВПС – 0,57055 [0, 32646; 0, 88270] (p ˂ 0,001). В группе детей с белыми типами ВПС, не вызывающими цианоза, их количество составляет 0,69495 [0, 58255; 0, 77916] (р ˂ 0,05). При этом возрастная динамика данных показателей в группах не имеет достоверных отличий.

 

Рис. 2. Содержание TРЭК в лимфоцитах периферической крови детей: * – достоверные различия с группой здоровых детей; ось х – группы детей, ось y – количество TРЭК (показатель 2–∆∆Ct)

 

Выводы

Таким образом, результаты исследования показали, что в тимусе у детей первого года жизни в условиях хронической гипоксии, обусловленной ВПС, наблюдается снижение основной функции тимуса, направленной на обеспечение организма ребенка Т-лимфоцитами. Установлено, что степень сложности ВПС коррелировала со степенью угнетения формирования пула Т-лимфоцитов. На протяжении длительного времени (эмбриональный и постнатальный период) гипоксия приводит к все более сильному угнетению пролиферации, дифференцировки тимоцитов, влияя на субпопуляционный состав клеток. В результате в периферическую кровь недостаточно поступают тимусные мигранты, что свидетельствует о низкой функциональной активности тимуса по обеспечению организма Т-клеточным ресурсом. Без сомнения, это является причиной иммунодефицитного состояния и снижения формирования адаптивного иммунитета у данной категории детей, что необходимо учитывать педиатрам при планировании лечебных и профилактических мероприятий с целью коррекции развития вторичных иммунодефицитов.

About the authors

N. P. Loginova

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: natalitsa@yandex.ru

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

V. A. Chetvertnykh

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: natalitsa@yandex.ru

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

G. A. Khromtsova

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: natalitsa@yandex.ru

кандидат медицинских наук, доцент кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

R. M. Shekhmametyev

Federal Center of Cardiovascular Surgery named after S.G. Sukhanov

Email: natalitsa@yandex.ru

заведующий кардиохирургическим отделением №4 (детское)

Russian Federation, Perm

L. A. Chetvertnykh

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: natalitsa@yandex.ru

кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической физиологии

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

References

Supplementary files