Особенности функционального состояния лимфоцитов у недоношенных новорожденных
- Авторы: Майден И.В.1, Спивак Е.М.1
-
Учреждения:
- ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России
- Выпуск: Том 36, № 6 (2019)
- Страницы: 27-32
- Раздел: Методы диагностики и технологии
- Статья получена: 29.01.2020
- Статья одобрена: 29.01.2020
- Статья опубликована: 30.01.2020
- URL: https://permmedjournal.ru/PMJ/article/view/19240
- DOI: https://doi.org/10.17816/pmj36627-32
- ID: 19240
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель. Дать характеристику функциональных свойств лимфоцитов периферической крови во взаимосвязи с особенностями периода неонатальной адаптации недоношенных новорожденных.
Материалы и методы. Обследованы 61 условно здоровый недоношенный ребенок со сроком гестации 28–37 недель, матери этих детей, а также 12 доношенных новорожденных. Функциональное состояние малых лимфоцитов оценивали по активности хроматина их ядер. С этой целью использовали цитохимический и флюорометрический методы с окраской мазков, полученных из лейкоцитарной взвеси, акридиновым оранжевым с последующим измерением интенсивности свечения в диапазоне световой волны 530–580 нм. Исследование проводили трижды: на 6-й, 16-й и 26-й дни жизни.
Результаты. В неонатальном периоде у недоношенных наблюдается рост абсолютного и относительного числа лимфоцитов. Указанные показатели имеют обратную зависимость от срока гестации. Активность хроматина ядер малых лимфоцитов у новорожденных значительно выше, чем у взрослых. Максимальные ее значения регистрируются у преждевременно родившихся детей. Малые лимфоциты недоношенных характеризуются выраженной функциональной гетерогенностью. Неблагоприятное течение неонатального периода у этих пациентов сопровождается более низкими значениями абсолютного числа лимфоцитов и активности хроматина их ядер.
Выводы. Показатель активности хроматина ядер малых лимфоцитов можно использовать для прогнозирования течения неонатального периода у преждевременно родившихся детей.
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ
Согласно данным эпидемиологических исследований, частота преждевременных родов составляет в среднем 10 % [1, 4]. Необходимым условием совершенствования выхаживания недоношенных детей является знание функциональных особенностей их физиологических систем, которые оказывают решающее влияние на процесс постнатальной адаптации [2]. Важность детального изучения становления клеточного иммунитета определяется высоким уровнем инфекционной заболеваемости среди этой категории пациентов [3].
Филогенетически клеточные механизмы защиты возникли раньше гуморальных; уже на 3–8-й неделях гестации в организме эмбриона обнаруживаются клетки-предшественники, общие для Т- и В-лимфоцитов. Результаты ряда исследований показывают, что функционирование эмбриональных лимфоцитов имеет качественные отличия, и к моменту рождения отмечается незрелость клеточного иммунитета. Основная функция Т-лимфоцитов у плодов и новорожденных – обеспечение противовоспалительного эффекта. Это связано с тем, что материнские изоантитела могут проникать через плаценту и действовать как антигены, вызывая иммунную реакцию со стороны плода [7]. По данным E. Marchant et al. (2015), у глубоконедоношенных новорожденных регистрируется высокий уровень системного воспаления, который объясняется наличием окислительного стресса из-за проведения искусственной вентиляции легких, высоких концентраций кислорода или генерализованной инфекции. При этом «преждевременное иммунное созревание» не заканчивается активным разрешением воспалительной реакции [6]. В работе M. Grespo et al. (2012) установлено, что «наивные» Т-лимфоциты новорожденных способны к специфической активации, причем у недоношенных эта особенность проявляется ярче. Подобный тип созревания Т-клеток не был обнаружен у взрослых. Авторы выдвигают гипотезу, согласно которой активация иммунной системы и воспалительные реакции у преждевременно родившихся детей могут лежать в основе патогенеза специфических для этой категории пациентов заболеваний – бронхолегочной дисплазии, респираторного дистресс-синдрома, некротического энтероколита, перивентрикулярной лейкомаляции и внутрижелудочковых кровоизлияний [5].
Важнейшую роль в регуляции активности клеток играют свойства хроматина. Он представляет собой комплекс, состоящий из ДНК, связанной со стабильным количеством гистоновых и меняющимся числом негистоновых белков. При отсутствии позитивного стимула лимфоциты находятся в «дремлющем» состоянии, морфологическим признаком которого является пахихроматическое (в виде плотных глыбок) состояние хроматина в ядрах. При его активации из-за происходящих процессов фосфорилирования и ацетилирования связь гистонов с ДНК ослабляется, и она переходит в более открытую форму, доступную для осуществления процессов транскрипции. Изменение физико-химических свойств хроматина является начальным этапом событий, приводящих к повышению его функциональной активности, и коррелирует с увеличением активности генома и адаптивными возможностями организма в целом.
Цель работы – дать характеристику функциональных свойств лимфоцитов периферической крови во взаимосвязи с особенностями периода неонатальной адаптации недоношенных новорожденных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под нашим наблюдением находился 61 условно здоровый недоношенный ребенок со сроком гестации от 28 до 37 недель (основная группа). Одновременно обследованы их матери. К условно здоровым отнесены дети без клинико-лабораторных признаков заболеваний, в том числе инфекционных, с функциональным состоянием органов и систем, соответствующим сроку гестации. Группу сравнения составили 12 доношенных новорожденных.
Материалом для исследования служила венозная кровь, из которой после центрифугирования получали лейкоцитарную взвесь. Последняя наносилась на покровное стекло, фиксировалась без подсушивания в течение 30 мин в смеси этанол – ацетон (1:1) при комнатной температуре. Препараты окрашивались акридиновым оранжевым по методу Rigler (1966) в модификации В.А. Колесникова и соавт. (1973). Образующийся комплекс ДНК – краситель обладает свойством флюоресценции в диапазоне световой волны 530–580 нм, при этом чем больше молекул ДНК способен связывать акридиновый оранжевый, тем выше интенсивность свечения в зеленой части спектра и, следовательно, активность хроматина. Ее измерение осуществляли на цитологических препаратах при помощи микроскопа ЛЮМАМ-И3 с фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А. Оценке подвергались малые лимфоциты (диаметром менее 6 мкм), большую часть из которых составляют Т-клетки.
Исследование активности хроматина ядер малых лимфоцитов проводилось трижды. Учитывая то обстоятельство, что первая декада жизни преждевременно родившихся детей соответствует фазе дезадаптации их функциональных систем и метаболических процессов, первый забор крови проводили на 6-й день жизни, а в дальнейшем во второй (16-й день) и третьей декадах (26-й день).
Статистическая обработка цифрового материала выполнялась с применением пакета прикладных программ StatPlus 2009 в среде Windows XP. Вариационные ряды анализировались на соответствие закону нормального распределения по Шапиро – Уилку. Достоверность различий средних величин при нормальном распределении определялась по критерию Стьюдента, в остальных случаях использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Значимость различий относительных величин (%) оценивали с помощью углового преобразования Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что на протяжении первого месяца постнатального развития у преждевременно родившихся детей наблюдается повышение количества лимфоцитов периферической крови (табл. 1). Во второй декаде жизни их средний прирост по отношению к возрасту 6 дней составляет 21,66 %, а в третьей – 32,49 %. Относительное содержание этих форменных элементов белой крови меняется в меньшей степени: на 3,7 и 13,9 % соответственно. Следовательно, можно сделать заключение о том, что адаптационные возможности недоношенного новорожденного в большей степени отражает именно абсолютное число лимфоцитов. Это подтверждается также анализом особенностей течения неонатального периода у преждевременно родившихся детей, о чем будет сказано ниже. Показатели как абсолютного, так и относительного количества лимфоцитов обнаруживают обратную зависимость от гестационного возраста.
Таблица 1
Количество лимфоцитов периферической крови у недоношенных новорожденных в зависимости от постнатального и гестационного возраста
Возраст детей | Количество лимфоцитов | |
абсолютное, 109/л | относительное, % | |
Постнатальный возраст | ||
6 суток | 3,97 ± 0,16 | 44,36 ± 1,36 |
16 суток | 4,83 ± 0,18*** | 46,00 ± 1,08 |
26 суток | 5,26 ± 0,18*** | 50,52 ± 0,96*** |
Гестационный возраст | ||
28–31 неделя | 4,25 ± 0,34 | 47,89 ± 2,95 |
32–37 недель | 3,53 ± 0,21* | 39,57 ± 2,12* |
Примечание: здесь и далее знаками *, ** и *** обозначены различия средних величин при значениях р < 0,05; р < 0,01 и р < 0,005 соответственно.
Выявлено, что у новорожденных детей, как доношенных, так и недоношенных, активность хроматина малых лимфоцитов значительно превышает таковую у взрослых (табл. 2), при этом у преждевременно родившихся детей данный показатель достоверно выше, чем в группе сравнения. Еще одной особенностью пациентов основной группы является выраженная функциональная гетерогенность лимфоцитов, что проявляется большим разбросом значений интенсивности флюоресценции, обнаружением в цитологических препаратах единичных клеток с ее увеличением в 2–4 раза. Активность хроматина имеет прямую корреляцию с постнатальным возрастом и обратную со сроком гестации. Таким образом, повышение данного показателя является, с одной стороны, свойством внутриутробного периода онтогенеза, а с другой – отражает процесс адаптации недоношенного ребенка к условиям внеутробного существования.
Таблица 2
Активность хроматина ядер малых лимфоцитов у новорожденных детей
Группа обследованных | Нормализованный показатель интенсивности флюоресценции, усл. ед. |
Взрослые | 100,1 ± 0,4 |
Доношенные новорожденные | 120,0 ± 0,5*** |
Недоношенные новорожденные (общая группа) | 137,9 ± 1,0*** |
По постнатальному возрасту | |
6 дней | 131,8 ± 1,9 |
16 дней | 138,3 ± 1,2** |
26 дней | 144,8 ± 2,0** |
По гестационному возрасту | |
28–31 неделя | 145,1 ± 1,1 |
32–37 недель | 140,9 ± 1,5* |
Таблица 3
Количество лимфоцитов периферической крови и активность хроматина у недоношенных новорожденных при различном течении неонатального периода
Показатель | Течение неонатального периода | |
благоприятное | неблагоприятное | |
Абсолютное количество лимфоцитов, 109/л | 6,7 ± 0,8 | 3,4 ± 0,5 ** |
Относительное количество лимфоцитов, % | 49,3 ± 7,8 | 49,5 ± 5,5 |
Нормализованный показатель интенсивности флюоресценции ядер малых лимфоцитов, усл. ед. | 135,5 ± 1,5 | 130,7 ± 1,6* |
Был проведен ретроспективный анализ изучаемых показателей лимфоцитарной системы в двух подгруппах недоношенных новорожденных по пять человек в каждой. Первая подгруппа включала детей с благоприятным, вторая – с неблагоприятным течением неонатального периода (возникновение инфекционно-воспалительной патологии). С целью нивелирования влияний гестационного и постнатального возраста для выполнения этой части работы были отобраны пациенты, родившиеся при практически равном сроке беременности (в среднем 32,4 ± 0,4 и 32,8 ± 0,5 недели, р > 0,05); забор крови у них проводился на 6-е сутки.
Установлено (табл. 3), что у недоношенных новорожденных с неблагоприятным течением неонатального периода отмечаются достоверно более низкие цифры общего числа лимфоцитов и активности хроматина их ядер. Одновременно различия в процентном содержании этих элементов белой крови отсутствуют, что является еще одним подтверждением большей диагностической и прогностической значимости показателя абсолютного количества лимфоцитов по сравнению с относительным у данной категории пациентов.
ВЫВОДЫ
- В течение периода новорожденности у недоношенных детей регистрируется рост абсолютного и в меньшей степени относительного числа лимфоцитов. Указанные показатели имеют обратную зависимость от срока гестации.
- Активность хроматина ядер малых лимфоцитов в период новорожденности значительно выше, чем у взрослых. Максимальные значения этого показателя регистрируются у преждевременно родившихся детей, достоверно превышая таковые у доношенных новорожденных. Малые лимфоциты недоношенных характеризуются выраженной функциональной гетерогенностью.
- Неблагоприятное течение неонатального периода у недоношенных новорожденных сопровождается более низкими значениями абсолютного числа лимфоцитов и активности хроматина их ядер. Это позволяет использовать указанные показатели для прогнозирования возникновения инфекционно-воспалительных заболеваний у данной категории пациентов.
Об авторах
Ирина Владимировна Майден
ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России
Автор, ответственный за переписку.
Email: irima-2009@mail.ru
доцент кафедры педиатрии № 1, кандидат медицинских наук
150000, Ярославль, ул. Революционная, д. 5Евгений Маркович Спивак
ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России
Email: spivak58@mail.ru
профессор кафедры педиатрии № 1, доктор медицинских наук
Россия, 150000, Ярославль, ул. Революционная, д. 5Список литературы
- Деев И.В., Куликова К.В., Кобякова О.С., Куликов Е.С. и др. Особенности физического и нервно-психического развития детей с низкой, очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении в различные периоды жизни. Педиатрическая фармакология 2016; 5 (13): 448–451.
- Карпова А.Л., Бокерия Е.Л., Николаева Т.Н. и др. Скрининговые технологии выявления врожденных пороков сердца у новорожденных. Неонатология: новости, мнения, обучение 2016; 2 (12): 40–49.
- Михалев Е.В., Саприна Т.В., Рафикова Ю.С. и др. Недоношенные дети: причины, последствия, прогноз. Красноярск 2016; 124.
- Рафикова Ю.С., Саприна Т.В., Лошкова Е.В., Михалев Е.В. Недоношенность и ее отдаленные метаболические последствия у детей и подростков. Педиатрия 2015; 5 (94): 132–142.
- Crespo M., Martinez D., Cerissi A. Neonatal T-cell maturation and homing receptor responses to Toll-like receptor ligands differ from those of adult naive T cells: relationship to prematurity. Basic Science Investigation, Pediatric Research 2012; 71: 136–143.
- Marchant E., Kan B., Sharma A. Attenuated innate immune defenses in very premature neonates during the neonatal period. Pediatric Research 2015; 78: 492–497.
- Zusman I. Immune systems and human intrauterine development. Transworld Research Network 2010; 342.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)