Characteristic features of functional status of lymphocytes in premature newborns

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Согласно данным эпидемиологических исследований, частота преждевременных родов составляет в среднем 10 % [1, 4]. Необходимым условием совершенствования выхаживания недоношенных детей является знание функциональных особенностей их физиологических систем, которые оказывают решающее влияние на процесс постнатальной адаптации [2]. Важность детального изучения становления клеточного иммунитета определяется высоким уровнем инфекционной заболеваемости среди этой категории пациентов [3].

Филогенетически клеточные механизмы защиты возникли раньше гуморальных; уже на 3–8-й неделях гестации в организме эмбриона обнаруживаются клетки-предшественники, общие для Т- и В-лимфоцитов. Результаты ряда исследований показывают, что функционирование эмбриональных лимфоцитов имеет качественные отличия, и к моменту рождения отмечается незрелость клеточного иммунитета. Основная функция Т-лимфоцитов у плодов и новорожденных – обеспечение противовоспалительного эффекта. Это связано с тем, что материнские изоантитела могут проникать через плаценту и действовать как антигены, вызывая иммунную реакцию со стороны плода [7]. По данным E. Marchant et al. (2015), у глубоконедоношенных новорожденных регистрируется высокий уровень системного воспаления, который объясняется наличием окислительного стресса из-за проведения искусственной вентиляции легких, высоких концентраций кислорода или генерализованной инфекции. При этом «преждевременное иммунное созревание» не заканчивается активным разрешением воспалительной реакции [6]. В работе M. Grespo et al. (2012) установлено, что «наивные» Т-лимфоциты новорожденных способны к специфической активации, причем у недоношенных эта особенность проявляется ярче. Подобный тип созревания Т-клеток не был обнаружен у взрослых. Авторы выдвигают гипотезу, согласно которой активация иммунной системы и воспалительные реакции у преждевременно родившихся детей могут лежать в основе патогенеза специфических для этой категории пациентов заболеваний – бронхолегочной дисплазии, респираторного дистресс-синдрома, некротического энтероколита, перивентрикулярной лейкомаляции и внутрижелудочковых кровоизлияний [5].

Важнейшую роль в регуляции активности клеток играют свойства хроматина. Он представляет собой комплекс, состоящий из ДНК, связанной со стабильным количеством гистоновых и меняющимся числом негистоновых белков. При отсутствии позитивного стимула лимфоциты находятся в «дремлющем» состоянии, морфологическим признаком которого является пахихроматическое (в виде плотных глыбок) состояние хроматина в ядрах. При его активации из-за происходящих процессов фосфорилирования и ацетилирования связь гистонов с ДНК ослабляется, и она переходит в более открытую форму, доступную для осуществления процессов транскрипции. Изменение физико-химических свойств хроматина является начальным этапом событий, приводящих к повышению его функциональной активности, и коррелирует с увеличением активности генома и адаптивными возможностями организма в целом.

Цель работы – дать характеристику функциональных свойств лимфоцитов периферической крови во взаимосвязи с особенностями периода неонатальной адаптации недоношенных новорожденных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под нашим наблюдением находился 61 условно здоровый недоношенный ребенок со сроком гестации от 28 до 37 недель (основная группа). Одновременно обследованы их матери. К условно здоровым отнесены дети без клинико-лабораторных признаков заболеваний, в том числе инфекционных, с функциональным состоянием органов и систем, соответствующим сроку гестации. Группу сравнения составили 12 доношенных новорожденных.

Материалом для исследования служила венозная кровь, из которой после центрифугирования получали лейкоцитарную взвесь. Последняя наносилась на покровное стекло, фиксировалась без подсушивания в течение 30 мин в смеси этанол – ацетон (1:1) при комнатной температуре. Препараты окрашивались акридиновым оранжевым по методу Rigler (1966) в модификации В.А. Колесникова и соавт. (1973). Образующийся комплекс ДНК – краситель обладает свойством флюоресценции в диапазоне световой волны 530–580 нм, при этом чем больше молекул ДНК способен связывать акридиновый оранжевый, тем выше интенсивность свечения в зеленой части спектра и, следовательно, активность хроматина. Ее измерение осуществляли на цитологических препаратах при помощи микроскопа ЛЮМАМ-И3 с фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А. Оценке подвергались малые лимфоциты (диаметром менее 6 мкм), большую часть из которых составляют Т-клетки.

Исследование активности хроматина ядер малых лимфоцитов проводилось трижды. Учитывая то обстоятельство, что первая декада жизни преждевременно родившихся детей соответствует фазе дезадаптации их функциональных систем и метаболических процессов, первый забор крови проводили на 6-й день жизни, а в дальнейшем во второй (16-й день) и третьей декадах (26-й день).

Статистическая обработка цифрового материала выполнялась с применением пакета прикладных программ StatPlus 2009 в среде Windows XP. Вариационные ряды анализировались на соответствие закону нормального распределения по Шапиро – Уилку. Достоверность различий средних величин при нормальном распределении определялась по критерию Стьюдента, в остальных случаях использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Значимость различий относительных величин (%) оценивали с помощью углового преобразования Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что на протяжении первого месяца постнатального развития у преждевременно родившихся детей наблюдается повышение количества лимфоцитов периферической крови (табл. 1). Во второй декаде жизни их средний прирост по отношению к возрасту 6 дней составляет 21,66 %, а в третьей – 32,49 %. Относительное содержание этих форменных элементов белой крови меняется в меньшей степени: на 3,7 и 13,9 % соответственно. Следовательно, можно сделать заключение о том, что адаптационные возможности недоношенного новорожденного в большей степени отражает именно абсолютное число лимфоцитов. Это подтверждается также анализом особенностей течения неонатального периода у преждевременно родившихся детей, о чем будет сказано ниже. Показатели как абсолютного, так и относительного количества лимфоцитов обнаруживают обратную зависимость от гестационного возраста.

 

Таблица 1

Количество лимфоцитов периферической крови у недоношенных новорожденных в зависимости от постнатального и гестационного возраста

Возраст детей	Количество лимфоцитов
	абсолютное, 109/л	относительное, %
Постнатальный возраст
6 суток	3,97 ± 0,16	44,36 ± 1,36
16 суток	4,83 ± 0,18***	46,00 ± 1,08
26 суток	5,26 ± 0,18***	50,52 ± 0,96***
Гестационный возраст
28–31 неделя	4,25 ± 0,34	47,89 ± 2,95
32–37 недель	3,53 ± 0,21*	39,57 ± 2,12*

Примечание: здесь и далее знаками *, ** и *** обозначены различия средних величин при значениях р < 0,05; р < 0,01 и р < 0,005 соответственно.

 

Выявлено, что у новорожденных детей, как доношенных, так и недоношенных, активность хроматина малых лимфоцитов значительно превышает таковую у взрослых (табл. 2), при этом у преждевременно родившихся детей данный показатель достоверно выше, чем в группе сравнения. Еще одной особенностью пациентов основной группы является выраженная функциональная гетерогенность лимфоцитов, что проявляется большим разбросом значений интенсивности флюоресценции, обнаружением в цитологических препаратах единичных клеток с ее увеличением в 2–4 раза. Активность хроматина имеет прямую корреляцию с постнатальным возрастом и обратную со сроком гестации. Таким образом, повышение данного показателя является, с одной стороны, свойством внутриутробного периода онтогенеза, а с другой – отражает процесс адаптации недоношенного ребенка к условиям внеутробного существования.

 

Таблица 2

Активность хроматина ядер малых лимфоцитов у новорожденных детей

Группа обследованных	Нормализованный показатель интенсивности флюоресценции, усл. ед.
Взрослые	100,1 ± 0,4
Доношенные новорожденные	120,0 ± 0,5***
Недоношенные новорожденные (общая группа)	137,9 ± 1,0***
По постнатальному возрасту
6 дней	131,8 ± 1,9
16 дней	138,3 ± 1,2**
26 дней	144,8 ± 2,0**
По гестационному возрасту
28–31 неделя	145,1 ± 1,1
32–37 недель	140,9 ± 1,5*

 

Таблица 3

Количество лимфоцитов периферической крови и активность хроматина у недоношенных новорожденных при различном течении неонатального периода

Показатель	Течение неонатального периода
	благоприятное	неблагоприятное
Абсолютное количество лимфоцитов, 109/л	6,7 ± 0,8	3,4 ± 0,5 **
Относительное количество лимфоцитов, %	49,3 ± 7,8	49,5 ± 5,5
Нормализованный показатель интенсивности флюоресценции ядер малых лимфоцитов, усл. ед.	135,5 ± 1,5	130,7 ± 1,6*

 

Был проведен ретроспективный анализ изучаемых показателей лимфоцитарной системы в двух подгруппах недоношенных новорожденных по пять человек в каждой. Первая подгруппа включала детей с благоприятным, вторая – с неблагоприятным течением неонатального периода (возникновение инфекционно-воспалительной патологии). С целью нивелирования влияний гестационного и постнатального возраста для выполнения этой части работы были отобраны пациенты, родившиеся при практически равном сроке беременности (в среднем 32,4 ± 0,4 и 32,8 ± 0,5 недели, р > 0,05); забор крови у них проводился на 6-е сутки.

Установлено (табл. 3), что у недоношенных новорожденных с неблагоприятным течением неонатального периода отмечаются достоверно более низкие цифры общего числа лимфоцитов и активности хроматина их ядер. Одновременно различия в процентном содержании этих элементов белой крови отсутствуют, что является еще одним подтверждением большей диагностической и прогностической значимости показателя абсолютного количества лимфоцитов по сравнению с относительным у данной категории пациентов.

ВЫВОДЫ

1. В течение периода новорожденности у недоношенных детей регистрируется рост абсолютного и в меньшей степени относительного числа лимфоцитов. Указанные показатели имеют обратную зависимость от срока гестации.
2. Активность хроматина ядер малых лимфоцитов в период новорожденности значительно выше, чем у взрослых. Максимальные значения этого показателя регистрируются у преждевременно родившихся детей, достоверно превышая таковые у доношенных новорожденных. Малые лимфоциты недоношенных характеризуются выраженной функциональной гетерогенностью.
3. Неблагоприятное течение неонатального периода у недоношенных новорожденных сопровождается более низкими значениями абсолютного числа лимфоцитов и активности хроматина их ядер. Это позволяет использовать указанные показатели для прогнозирования возникновения инфекционно-воспалительных заболеваний у данной категории пациентов.

About the authors

I. V. Maiden

Yaroslavl State Medical University

Author for correspondence.
Email: irima-2009@mail.ru

доцент кафедры педиатрии № 1, кандидат медицинских наук

Yaroslavl

E. M. Spivak

Yaroslavl State Medical University

Email: spivak58@mail.ru

профессор кафедры педиатрии № 1, доктор медицинских наук

Russian Federation, Yaroslavl

References

Supplementary files