NT-proBNP content in seminal plasma of ejaculate in normal conditions and in oligozooastenospermia

Full Text

Введение

В структуре бесплодия семейных пар, инфертильность, обусловленная так называемым «мужским фактором», составляет примерно 40 % [1, 2]. Современное развитие вспомогательных репродуктивных технологий позволяет даже мужчинам с выраженным нарушением сперматогенеза становиться отцами [3].

Важную роль в определении причины бесплодия при обследовании семейной пары играет диагностика органических нарушений со стороны репродуктивных органов у мужчины. Сбор анамнеза, физикальное обследование и использование визуализирующих методов (УЗИ, КТ, МРТ) позволяет диагностировать ряд заболеваний, влияющих на фертильность мужского населения [4, 5]. Однако наиболее важная роль в установлении роли «мужского фактора» принадлежит исследованию эякулята [6]. В литературе описана взаимосвязь изменений белкового спектра эякулята с функционально-морфологическими характеристиками сперматозоидов [7–9]. Представляется перспективным поиск компонентов семенной плазмы, которые могут рассматриваться как диагностически значимые маркеры нарушений сперматогенеза и заболеваний органов мужской репродуктивной системы. Среди возможных маркеров интерес представляют белки сыворотки крови, для которых созданы хорошо охарактеризованные тест-системы. Так, в клинико-диагностических лабораториях широко исследуется метаболит, формирующийся в ходе процессинга молекулы мозгового натрийуретического пептида (BNP), так называемый (NT-proBNP). В практике КДЛ определение его концентрации широко используется как показатель, характеризующий тяжесть сердечной недостаточности [10, 11]. Кроме того, в последние годы этот белок обнаружен не только в сыворотке крови, но и в других биологических жидкостях, например слезе, слюне, моче, что указывает на возможную роль натрийуретических пептидов в функционировании органов, продуцирующих данные биологические жидкости [12–14]. Однако нами не обнаружены публикации, посвященные анализу NT-proBNP в эякуляте человека, что при наличии доступных тест-систем определяет актуальность проведения исследований по его содержанию в сперме, в том числе для выявления его взаимосвязи с количественными показателями сперматозоидов и оценки возможной маркерной роли этого белка в мужском бесплодии.

Цель исследования – изучение изменения концентрации NT-proBNP в образцах эякулята здоровых и мужчин с олигозооастеноспермией.

Материалы и методы исследования

В исследование были включены 52 мужчины репродуктивного возраста (34,4 ± 3,9 г.), проходивших обследование с целью уточнения причины бесплодного брака. У всех обследованных отсутствовали изменения в общем и биохимическом анализах крови, общем анализе мочи. Исследование выполнено с соблюдением этических принципов проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов, изложенных в Хельсинкской декларации Всемирной организации здравоохранения.

Образцы эякулята были собраны после 2–4 дней полового воздержания и оценивались в соответствии с рекомендациями ВОЗ по показателям, характеризующим их фертильность [15]. Определяли объем эякулята. Для подсчета концентрации и общего количества сперматозоидов, а также оценки их подвижности использовали анализатор спермы SQA–V (MES, Израиль). При низкой концентрации сперматозоидов (менее 1 млн/мл) их подсчет проводили в камере Горяева.

Семенную плазму отделяли путем центрифугирования при 2000 g (3000 об/мин) в течение 15–20 мин на центрифуге СМ-6М (ELMI, Латвия). Аликвоты супернатантов биологического материала переносили в пробирки Эппендорф и хранили до исследования при температуре –40 °С.

Концентрацию NT-proBNP определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы «NT-proBNP – ИФА – БЕСТ» (А-9102), производство ООО «Вектор-Бест», Россия. Оптическую плотность проб регистрировали на вертикальном фотометре StatFax 3200 (Awareness, США).

В зависимости от результатов лабораторного анализа спермы обследованные были разделены на две группы, сопоставимые по возрасту. Основную группу (группа 1, n = 18) составили мужчины со сниженной фертильностью эякулята, характеризовавшегося уменьшением концентрации сперматозоидов и/или их общего содержания. В группу сравнения (группа 2, n = 34) вошли мужчины с нормальными показателями концентрации и общего содержания сперматозоидов (таблица).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 7 (StatSoft Inc., США). Для каждого массива данных рассчитывали параметры описательной статистики: среднюю арифметическую (М), стандартное отклонение (SD), медиану (Me) и интерквартильный диапазон

 

Характеристика эякулята обследованных

Показатель	Основная группа, n = 18	Группа сравнения, n = 34	p
Объем, мл	3,2 ± 1,7 2,5(2,3–2,7)   2,0–7,8	3,3 ± 0,7 3,3(2,7–3,7)   2,2–5,1	0,007947
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	10,72 ± 5,0 8,7(8,2–13,5)   5,8–14,7	87,29 ± 37,12 82,6(57,9–110,6)   33,1–174,4	< 0,000001
Количество сперматозоидов, млн/эякулят	31,78 ± 17,79 24,3 (17,8–42,4)   16,38–76,32	294,64 ± 148,73 293,2 (138,9–279,7)   78,1–679,32	< 0,000001

Примечание: в числителе: среднее значение ± стандартное отклонение (M ± SD), в знаменателе: медиана и интерквартильный диапазон (Me; 25 % квартиль – 75 % квартиль); p – различие между группами по критерию Манна – Уитни.

 

(25–75%-ный процентиль), а также минимальное (min) и максимальное (max) значение. Массивы данных оценивали на наличие и степень выраженности выбросов. Полученные результаты оценивались с использованием критерия Шапиро – Уилка. Эти данные позволили отвергнуть нулевую гипотезу о нормальном характере их распределения и послужили основанием для отказа от использования параметрических критериев при выполнении дальнейшего статистического анализа. Для сравнения двух независимых выборок использовали U-критерий Манна – Уитни. Количественная оценка линейной связи между двумя случайными величинами определялась с использованием коэффициента ранговой корреляции (R) по Спирмену. За максимально приемлемую вероятность ошибки первого рода (р) принималась величина уровня статистической значимости, равная или меньшая 0,05.

Результаты и их обсуждение

Среднее значение содержания NT-proBNP в эякуляте (n = 52) составило 29,498 пг/мл, медиана концентрации 2,860 пг/мл, и характеризовалось высокой вариабельностью (рис. 1). В 62 % (32 из 52) исследованных образцов семенной плазмы значение NT-proBNP было ниже 20 пг/мл. Частота образцов с таким низким содержанием NT-proBNP статистически значимо не различалась между группами (p = 0,162). В основной группе число таких образцов составило 44 % (8 образцов из 18), а в группе сравнения – 65 % (12 образцов из 34).

При сравнении содержания NT-proBNP в семенной плазме между группами не обнаружено статистически значимых различий. Среднее содержание NT-proBNP во всех образцах семенной плазмы обследованных основной группы (n = 18) составило 8,38 ± 16,83 пг/мл, медиана и интерквартильный диапазон составили соответственно 2,44 (≈ 0–4,26) пг/мл; диапазон значений колебался от ≈ 0 до 55,673 пг/мл. В группе сравнения эти показатели составили соответственно 40,68 ± 62,32 пг/мл, 3,29 (≈ 0–52,5) пг/мл, диапазон колебаний ≈ 0–189,658 пг/мл. Однако при статистической обработке полученных данных полученные результаты статистически не отличались (U-критерий Манна – Уитни = 243,0; p = 0,229308).

Анализ корреляционных отношений между показателями фертильности эякулята и содержанием NT-proBNP также не выявил статистически значимой зависимости.

Зависимость концентрации сперматозоидов от концентрации NT-proBNP в семенной плазме

 

Рис. 1. Концентрация NT-proBNP в семенной плазме обследованных: все – данные в двух исследуемых группах, 1 – основная группа; 2 – группа сравнения

 

характеризуется отсутствием значимой корреляционной закономерности (R = 0,270344) и описывается уравнением линейной регрессии (рис. 2):

 

Концентрация сперматозоидов (млн/мл) = = 51,3154+0,3215x,

 

где х = концентрация NT-proBNP в семенной плазме, пг/мл.

Анализ корреляционных отношений также не обнаружил статистически достоверной зависимости между общим количеством сперматозоидов в эякуляте и уровнем NT-proBNP (R = 0,315081):

 

Количество сперматозоидов (млн/эякулят) = = 128,1238+1,331x,

 

где х = концентрация NT-proBNP в семенной плазме, пг/мл.

Натрийуретические пептиды принадлежат к семейству небольших белков, которые играют главную роль в модуляции натрийуреза, диуреза и вазодилатации [16, 17]. Семейство натрийуретических пептидов у млекопитающих состоит из структурно родственных пептидов: предсердного натрийуретического пептида (ANP), мозгового натрийуретического пептида (BNP) и последовательно открытых друг за другом CNP и других, названных так исходя из алфавитной последовательности [18]. Все три члена группы натриуретических пептидов проявляют свои биологические эффекты через два разных мембраносвязанных рецептора для натрийуретических пептидов (NPR-A и NPR-B). Было показано, что ANP и BNP связываются преимущественно с NPR-A, тогда как CNP проявляет большее сродство к NPR-B, который считается специфическим рецептором CNP [19]. NPR-A связывает натрийуретические пептиды при стехиометрии 2:1 с предпочтительным натрийуретическим пептидом ранга: ANP ≥ BNP >> CNP; NPR-B связывает натрийуретические пептиды с предпочтением селективности CNP >> ANP ≥ BNP [20]. CNP не увеличивает накопление уанозин-3',5'-монофосфата в клетках, экспрессирующих человеческий NPR-A, сродство CNP к NPR-B в десятки и сотни раз выше, чем ANP или BNP, соответственно [21].

На основании полученных результатов невозможно сделать однозначные выводы о клинико-

 

Рис. 2. Зависимость концентрации сперматозоидов от уровня NT-proBNP в семенной плазме

 

диагностическом значении определения NT-proBNP в семенной плазме и наличии четких показаний к исследованию данного белка, однако, по нашему мнению, полученные результаты имеют определенную научную ценность.

Несмотря на многочисленные исследования натрийуретических пептидов, в частности NT-proBNP в сыворотке крови, и определение их в других биологических жидкостях человеческого организма – внутриглазной жидкости и слезе [11, 22, ], слюне [12, 23], ликворе [24], экссудатах [25], в моче [26], в литературе на сегодняшний день практически отсутствуют данные об исследовании этого белка в эякуляте. Сообщение о полученных нами результатах является первой публикацией о содержании этого белка в семенной плазме. Значительный разброс данных (от неопределяемо низких значений до величин, характерных для сыворотки пациентов с сердечной недостаточностью (более 130 пг/мл)) указывает на необходимость дальнейшего изучения возможного источника NT-proBNP и особенностей метаболизма не только мозгового натрийуретического пептида, но и других натрийуретических пептидов. Следует учитывать, что NT-proBNP является всего лишь неактивным метаболитом BNP. В отличие от активных натрийуретических пептидов, длительность периода полураспада которых исчисляется десятками минут, период циркуляции NT-proBNP составляет несколько часов. Возможно, что концентрация NT-proBNP в семенной плазме является лишь усредненным результатом продукции BNP.

На целесообразность дальнейших исследований указывают материалы публикации о роли натрийуретического пептида С-типа в функционировании сперматозоидов [16]. В исследованиях, выполненных Xia H. еt al. [16], установлено присутствие в области акросомы специфических рецепторов NPR-B, способных связывать натрийуретические пептиды С-типа. И, несмотря на то что авторами не обнаружена экспрессия натрийуретического пептида С-типа в сперматозоидах, их инкубация в присутствии различных концентраций натрийуретического пептида С-типа демонстрировала дозозависимое увеличение подвижности сперматозоидов и выраженность акросомальной реакции [16].

В литературе приводятся данные о важной роли натрийуретических пептидов в репродукции млекопитающих. Например, в экспериментах на мышах установлено, что самки мышей, гомозиготные по мутации, приводящей к отсутствию экспрессии рецептора NPR-B (генотип NPR-B -/-), – стерильны [16, 27].

При исследованиях натрийуретических пептидов в мужских репродуктивных органах получены данные о возможной паракринной роли натрийуретического пептида С-типа. В частности, установлена его секреция преимущественно клетками Лейдига и наличие рецепторов NPR-B преимущественно на клетках Сертоли [26].

Продемонстрировано влияние местных инъекций натрийуретических пептидов: ANP, BNP и CNP на микроциркуляцию в ткани яичек. Авторы выявили также дозозависимое увеличение кровотока в яичках при введении натрийуретических пептидов, которое блокируется при введении их антагонистов [28]. Иммунореактивный (ir) CNP и ir BNP были обнаружены в клетках Лейдига, тогда как в ANP наблюдались в семенных канальцах [28]. Предполагается, что натрийуретические пептиды могут играть важную роль в местной регуляции микроциркуляции яичек.

Выводы

Таким образом, нами впервые представлены данные о содержании NT-proBNP в эякуляте человека. NT-proBNP представляет собой пептид, образующийся в ходе процессинга белка, предшественника BNP, который путем ограниченного протеолиза расцепляется на активный BNP и неактивные N-терминальные пептиды (NT-proBNP). NT-proBNP характеризуется более значительным периодом циркуляции в крови, и именно по его содержанию в сыворотке крови оценивают продукцию BNP и стратифицируют тяжесть сердечной недостаточности [18, 20]. Возможно, что значительный диапазон значений концентрации NT-proBNP, обнаруженный нами, свидетельствует о различиях в продукции BNP в органах мужской репродуктивной системы. Вероятным эффектом натрийуретических пептидов может являться регуляция локального кровотока в органах мужской репродуктивной системы, в частности в тестикулах. Также мы не исключаем возможность участия BNP в регуляции подвижности сперматозоидов и акросомальной реакции. Требуется продолжение изучения указанных протеинов в норме и при заболеваниях органов мужской репродуктивной системы.

Благодарность

Авторы статьи выражают благодарность сотрудникам ООО «МедЛабЭкспресс» (г. Пермь), заведующей лабораторией канд. мед. наук О.Ю. Ненашевой и Н.А. Каленс- кой за помощь в анализе спермограмм и консервации подходящих образцов материала.

Финансирование. Исследование выполнено на средства гранта Федерации лабораторной медицины (ФЛМ) по договору о предоставлении гранта от 11 декабря 2019 года (протокол президиума ФЛМ от 25.06.2019).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Dmitriy Yu. Sosnin

E.A. Vagner Perm State Medical University; Ltd “MedGarant”

Author for correspondence.
Email: sosnin_dm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1232-8826

MD, PhD, Professor, Department of Faculty Therapy №2, Professional Diseases and Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Perm

Konstantin R. Galkovich

Ltd “MedGarant”; Perm Institute of Healthcare Workers Advanced Training

Email: kr20211@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9039-7117
SPIN-code: 3576-0522

Candidate of Medical Sciences, urologist

Russian Federation, Perm

A. V. Krivtsov

Laboratory of Immunogenetics of Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies

Email: krivtzov@mai.ru

Candidate of Medical Sciences, Head of Laboratory of Immunogenetics

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files