Staphylococcus aureus as a target of peripheral blood microbicidal factors from healthy donors

Full Text

Введение

В последнее время отмечается неуклонный рост числа инфекционно-воспалительных заболеваний, обусловленных условно патогенными микроорганизмами [1–3]. Среди причин такой ситуации следует выделить бактерионосительство и ослабление антимикробной активности иммунной системы. Уникальным симбиозом можно назвать персистенцию у здоровых лиц Staphylococcus aureus в разных локусах организма [4]. Согласно данным ВОЗ, 20% практически здоровых людей являются постоянными носителями S. aureus, а еще 70 % – так называемыми «перемежающимися» носителями, когда этот вид микроорганизма выделяется многократно, но присутствуют различия штаммовой структуры по ряду показателей [5]. Наиболее часто встречается носительство S. aureus в кишечнике, на коже и слизистых оболочках [4].

Из факторов иммунной системы фагоцитарная активность лейкоцитов занимает ведущее место среди механизмов элиминации S. aureus. Так, при снижении числа нейтрофилов или нарушении их функциональной активности существенно увеличивается встречаемость инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных S. aureus [6]. Кроме этого, показано, что фагоцитарная активность лейкоцитов увеличивается при опсонизации стафилококков иммуноглобулином G [7]. Однако эффективность опсонизации зависит от количества и репертуара специфичности антител.

Цель исследования – оценить бактериолитическую активность периферической крови здоровых доноров против S. aureus.

Материалы и методы исследования

В исследование включены 32 практически здоровых добровольца. Кровь получали утром натощак. При определении бактерицидной активности цельной крови пробы делили на три порции. Первую порцию крови смешивали с тест-штаммом Staphylococcus aureus АТСС 25923 и сразу же использовали для посева (контрольная проба). Вторую порцию крови смешивали с опсонизированными, а третью – с неопсонизированными микроорганизмами. Опсонизацию осуществляли коммерческим препаратом «Октогам», содержащим иммуноглобулин класса G с широким спектром специфических антител. Рабочая концентрация препарата по иммуноглобулину класса G была 20 мг/мл [8, 9]. Опсонизацию микроорганизмов осуществляли в течение часа при температуре 37 °С. Микробицидную активность тестировали после инкубации крови с микроорганизмами в течение 3 ч при температуре 37 °С. Посев образцов для подсчета выросших колоний осуществляли на желточно-солевой агар.

Биопленки S. aureus АТСС 25923 выращивали в плоскодонных полистироловых планшетах в течение 24 ч при 37 ^оС. После этого удаляли питательный бульон и промывали планшеты забуференным физиологическим раствором. На пленки наносили цельную кровь или плазму на 1 ч, инкубацию осуществляли в термостате при 37^оС. В контрольные пробы вносили равный объем питательного бульона. Для визуализации биопленок применяли метод O’Toole [10]: толщину биопленок определяли при помощи окраски генцианвиолетом с последующей его экстракцией спиртом и учетом оптической плотности на фотометре.

При определении поглотительной активности лейкоцитов все пробы периферической крови делили на две порции. В 1-ю порцию вносили опсонизированные клетки S. aureus АТСС 25923, во 2-ю – неопсонизированные микроорганизмы. Сущность метода аналогична описанному в [11], за исключением того, что в качестве объекта фагоцитоза выбраны клетки S. aureus. Оценка числа нейтрофилов и моноцитов, фагоцитирующих бактерии, проведена на микропрепаратах, окрашенных по методу Романовского – Гимзе. В каждом препарате учитывали не менее 300 фагоцитирующих клеток. Рассчитывали процент фагоцитирующий клеток каждого типа, фагоцитарное число (среднее число S. aureus, приходящееся на одну фагоцитирующую клетку), а также абсолютные показатели фагоцитарной активности клеток.

Для определения радикал-продуцирующей активности лейкоцитов при постановке реакции люминолзависимой хемилюминесценции в стимулированном варианте в лунках планшета (Corning Inc. Costar) смешивали лейкоциты (25·10⁶/мл) и взвесь тест-штамма S. aureus АТСС 25923. В спонтанном варианте реакции смешивали те же компоненты, но вместо тест-штамма вносили раствора Хенкса. Измерение проводили на люминометре Luminoskan Ascent® Thermo Labsystems (США) в течение 180 мин. Для статистического анализа использовали интегральный показатель хемилюминесценции за весь период измерения (integral, RLU) [12].

Статистический анализ проводился с помощью программного пакета Statistica 6.0. Вычислялась средняя арифметическая величина (М) и стандартная ошибка средней арифметической (m). Для проверки нормальности распределения использован критерий Шапиро – Уилка. В случае распределения приближенного к нормальному использовали критерий Стьюдента, в остальных – применяли критерий Манна – Уитни для оценки значимости различий. Критический уровень значимости (p) при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты и их обсуждение

При определении бактерицидной активности цельной периферической крови здоровых добровольцев не выявлено существенного изменения числа жизнеспособных S. aureus за 180 мин контакта с кровью. Так, до инкубации количество бактерий составило 1218,6 ± 239,0 КОЕ, а в 180-ю мин – 768,9 ± 121,9 КОЕ (p > 0,05).

Тест-штамм S. aureus формирует довольно выраженную биопленку – 1,096 ± 0,239 усл. ед. При инкубации такой биопленки с цельной кровью ее толщина уменьшается до 0,323 ± ± 0,060 (p < 0,05), а со свежеполученной сывороткой крови – до 0,131 ± 0,002 усл. ед. оптической плотности (p < 0,05). После прогревания сыворотки при 56 ^оС ее эффект на толщину биопленки нивелировался.

Число нейтрофилов, фагоцитирующих S. aureus, составило 23,7 ± 4,4 %, а моноцитов – 13,8 ± 2,2 % (p = 0,050). Половину фагоцитирующих нейтрофилов и моноцитов можно отнести к активно поглощающим клеткам, так как они захватывали более двух микробных клеток. В целом только пятая часть лейкоцитов поглощали клетки S. aureus. После опсонизации микробных клеток препаратом иммуноглобулина G показатели фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов существенно не изменились. Однако при оценке суммарных показателей для всего пула лейкоцитов отмечено, что после опсонизации объектов наблюдается увеличение фагоцитарного индекса и снижение относительного числа нефагоцитирующих лейкоцитов.

При анализе радикал-продуцирующей активности лейкоцитов выявлено, что свежеполученная сыворотка обладает выраженным стимулирующим влиянием на продукцию гидроксильных радикалов лейкоцитами (2758,7 ± 725,3 и 870,6 ± 197,4 RLU соответственно; p < 0,05). После прогревания сыворотки при 56 ^оС стимулирующий эффект нивелировался (1091,1 ± 234,7 RLU; p > 0,05 к пробам с неопсонизированными объектами), что указывает на существенный вклад компонентов комплемента в активацию продукции гидроксильного радикала.

Золотистый стафилококк является уникальным микроорганизмом, обладающим широким спектром факторов патогенности, благодаря которым удается успешно противостоять иммунной системе. Все это позволяет штаммам золотистого стафилококка колонизировать биотопы организма человека и существовать там относительно долгое время. У S. aureus описаны системы противодействия иммунным факторам [13]. Так, показано, что S. aureus способны выживать в нейтрофилах и моноцитах [14], клетках ткани полипов носа [15], слизистой оболочки носа пациентов с синуситами [16] и в клетках ткани преддверия носа здоровых индивидуумов [17], что, в свою очередь, обеспечивает диссеминацию микроорганизмов. Кроме этого, внутриклеточная локализация позволяет S. aureus сохранять популяцию и восстанавливать численность практически до исходного уровня после терапии топическими препаратами [17]. Более того, при внутриклеточной локализации, особенно в нефагоцитирующих клетках, S. aureus становятся недоступными для белков системы комплемента, «профессиональных» фагоцитов и иммуноглобулинов. Установлено, что после интернализации клеток S. aureus наблюдается снижение метаболической активности бактерий [18]. У таких вариантов снижаются до полного прекращения гемолитическая и цитотоксическая активности, но повышается экспрессия факторов адгезии, что в целом указывает на адаптацию бактерий к длительному внутриклеточному сосуществованию [19]. Процесс формирования метаболически неактивных штаммов может быть инициирован антибиотиками [20]. Описан процесс реверсии метаболически неактивных штаммов в исходный фенотип, но механизм до конца не выяснен.

Таким образом, S. aureus уникально адаптировался к организму человека, успешно выдерживает и более того уходит от воздействия факторов иммунной системы. Все это позволяет стафилококкам персистировать длительное время без клинических проявлений и наращивать свой патогенный потенциал.

Выводы

1. Можно предположить, что среди факторов иммунной системы, вероятно, наиболее эффективным бактерицидным действием обладают белки системы комплемента, разрушающие как клетки aureus, так и матрикс биопленки. Однако эффективность этой системы находится в зависимости от белоксинтезирующей функции печени, доступности микроорганизмов действию комплемента.
2. Интернализированный aureus клетками человека практически недоступен для антибиотиков и иммунной системы, что создает возможность для персистенции микроорганизмов и периодической реактивации воспалительного процесса.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Anatoliy P. Godovalov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: AGodovalov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5112-2003
SPIN-code: 4482-4378

Candidate of Medical Sciences, leading researcher of Central Scientific Research Laboratory, Associate Professor of Department of Microbiology and Virology

Russian Federation, Perm

Iosif A. Boev

City Dental Clinic № 3

Email: iosifboev@gmail.com
SPIN-code: 3855-0045

student of dentistry faculty, Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files