Features of amniotic fluid microbiota in full-term pregnancy

Full Text

Введение

В последние несколько лет после публикации ряда исследований, связанных с изучением микробиома человека (The Human Microbiome Project – HMP), произошла смена парадигмы о безусловной стерильности плодных оболочек, плаценты и околоплодных вод при физиологически протекающей беременности. Ранее считалось, что полость матки, плацента, плод и околоплодные воды должны быть стерильны, что обеспечивает рождение здорового ребенка при доношенной беременности.

Недавние исследования имеют противоречивые данные о наличии микробиоты внутри амниотической полости. Исходно предполагалось, что амниотическая полость стерильна, новорожденные рождаются и колонизируются по-разному в зависимости от способа родоразрешения (например кесарево сечение или вагинальные роды) [1, 2]. Однако появились исследования, показывающие наличие низкой бактериальной массы и низкой численности микробов в децидуальной оболочке, фаллопиевых трубах, в амниотической жидкости, плаценте, амнионе и хорионе, что в свою очередь свидетельствует о воздействии микробов (или по крайней мере их метагеномов) на физиологически развивающийся плод еще задолго до родов [3–8]. В целом изучение влияния изменения качественного и количественного состава околоплодных вод на состояние плода и новорожденного при доношенной беременности является актуальным [9].

По мнению ряда авторов [10, 11], внутриамниотическая полость по степени микробной обсемененности отличается от плаценты. Предполагается, что плацента отдельно колонизирована микробами и, возможно, ее защитные механизмы препятствуют проникновению этих бактерий в околоплодные воды [12].

Часть исследований демонстрирует, что при физиологически протекающей беременности при культуральном исследовании амниотическая жидкость в середине второго триместра стерильна [13–16], а выявление даже незначительного количества изолированных бактерий ассоциировано с различными осложнениями беременности: преждевременные роды, преждевременный разрыв плодных оболочек, преэклампсия, синдром задержки развития плода [14]. По данным других авторов, выявление любых микроорганизмов в околоплодных водах является признаком внутриутробной инфекции и хориоамнионита [17, 18], однако не всегда при клинических признаках хориоамнионита удается выявить микробную инвазию амниотической полости. При этом более современные способы диагностики микроорганизмов, такие как секвенирование, ПЦР-диагностика, демонстрируют наличие бактериальных сообществ в небольшом количестве в околоплодных водах при доношенной физиологически протекающей беременности [19, 20].

Таким образом, прежде чем отнести различные микроорганизмы, выявленные в фетоплацентарном комплексе, к факторам риска развития материнских и перинатальных осложнений, необходимо иметь четкое представление о его нормальной микробиоте.

Цель исследования – изучение микробного пейзажа околоплодных вод при доношенной физиологически протекающей беременности с интактным плодным пузырем.

Материалы и методы исследования

Для реализации поставленной цели были включены в исследование 19 беременных в сроке беременности 37–41 неделя, с интактными плодными оболочками без признаков начала родовой деятельности, исследование проводилось на базе родильных отделений ГБУЗ ГКБ№ 1 им. Н.И. Пирогова, г. Самара. Все пациентки были родоразрешены путем операции кесарева сечения в плановом порядке (показаниями к операции являлись неправильное положение и предлежание плода, наличие рубца на матке после предыдущей операции кесарева сечения, бесплодие в сочетании с отягощенным акушерским анамнезом или возрастом).

Критерии исключения:

1. Критериями исключениями из исследования являлись: беременные, относящиеся к группе высокого риска, согласно порядку оказания помощи по профилю «Акушерство и гинекология» № 572 от 01.11.2012 г., по соматической патологии (сахарный диабет, гестационный диабет), особенностям плацентации.
2. Наличие острых и обострения хронических воспалительных заболеваний, в том числе наличие кольпита.
3. Антибактериальная терапия во время беременности.

Всем пациенткам было выполнено исследование амниотической жидкости методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (набор «Фемофлор 16») и применением детектирующего амплификатора ДТ-96 производства ООО «НПО ДНК-Технология» (РУ ФСР 2009/04663, патент № 2362808 от 13.02.08). ПЦР-исследования осуществлялись на базе лаборатории научного отдела компании ООО «НПФ ДНК-Техно логия». Забор амниотической жидкости проводился интраоперационно при вскрытии матки и плодного пузыря с применением специального разработанного устройства для сбора околоплодных вод [21], препятствующего загрязнению материала во время операции. Исходно методика «Фемофлор-16» была разработана для оценки состояния влагалища, в данном случае применялась с целью оценки микробного состава околоплодных вод. Технология предусматривает анализ биоты различных биотопов, в том числе может быть использована для анализа амниотической жидкости [22–24], включающего определение микроорганизмов: Lactobacillus spp., Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp. / Fusobacterium spp, Megasphaera spp. / Veillonella spp. / Dialister spp., Lachnobacterium spp. / Clostridium spp., Mobiluncus spp. / Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma (urealyticum + parvum), Candida spp., Mycoplasma henitalium.

Околоплодные воды подвергали центрифугированию в течение 15 мин при 2000g, удалялся супернатант, осадок переносился в транспортную среду («Проба-Рапид», производство ООО «НПО ДНК-Технология»). Затем выполнялся анализ методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.

После амплификации автоматически устанавливали общее количество бактериальной массы (ОБМ) – лабораторная ОБМ, Lacto bacillus spp. и различных видов условно-патогенных микроорганизмов согласно возможностям панели «Фемофлор-16». Все образцы имели достаточное количество взятого материала (КВМ) для проведения оценки выявленных микроорганизмов. Количественная оценка приводилась как в абсолютных, так и в относительных показателях к лабораторной ОБМ. Абсолютный показатель – количество ДНК искомого микроорганизма в образце, выраженное в ГЭ, представленное в виде десятичного логарифма – lg. Рассчитанная ОБМ представляет собой суммарное количество микроорганизмов в процентах.

Обработку результатов исследования проводили с помощью программы Statistica 10.0, SPSS 13. Результаты исследования ПЦР-РВ представлены в виде среднего (М) абсолютного количества микроорганизмов в десятичных логарифмах. Частота выявления микроорганизмов – в процентах, а также в относительных процентах – относительно лабораторной ОБМ. Количественные показатели представлены средним арифметическим десятичных логарифмов (М) со стандартным отклонением (δ). Сравнение абсолютного количества в группах выполнялось с помощью критерия Манна – Уитни.

Результаты и их обсуждение

Согласно критериям исключения пациентки не имели соматической патологии, средний возраст составил – 29,1 ± 5,9 г., из них у 30 % предстояли первые роды, паритет беременности в среднем составил 2,8 ± 2,1. Срок гестации в среднем 39,8 ± 0,78 недели (39–40,5 недели). В табл. 1 представлен микробный пейзаж каждой обследуемой.

 

Таблица 1. Микробный пейзаж околоплодных вод пациенток (значения представлены в виде lg)

Результат «Фемофлор-16»

Порядковый номер обследуемой

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

КВМ

5,3

5,4

4,4

4,4

5,1

4,1

4,2

3,5

4,6

5,2

3,4

4,9

4

3,7

4,3

4,2

3,8

3,8

4,2

ОБМ лабораторная

–

3,1

–

3,1

3,3

3,5

3,3

–

3,5

3,6

3,7

–

–

–

–

3,4

–

–

0,7

ОБМ расчетная

–

–

–

–

3,1

3,5

–

–

3,5

3,6

3,1

–

–

–

–

–

–

–

0,7

Lactobacillus spp.

–

–

–

–

–

–

–

–

3,3

-

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Enterobacteriaceae spp.

–

–

–

–

–

3,1

–

–

3

3,6

3,1

–

–

–

–

–

–

–

–

Streptococcus spp.

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Staphylococcus spp.

–

–

–

–

–

3

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Gardnerella vaginalis + Prevotella bivia + Porphyromonas spp.

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Eubacterium spp.

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Sneathia spp. + Leptotrichia spp. + Fusobacterium spp.

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Megasphaera spp. + Veillonella spp. + Dialister spp.

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Lachnobacterium spp. + Clostridium spp.

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Mobiluncus spp. + Corynebacterium spp .

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Peptostreptococcus spp.

–

–

–

–

3,1

3,1

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Atopobium vaginae

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Candida spp.

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

0,7

Mycoplasma hominis

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Ureaplasma (urealyticum + parvum)

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Mycoplasma genitalium

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

Неизвестные виды

–

3,1

–

3,1

2,9

–

3,3

–

–

–

3,6

–

–

–

–

3,4

–

–

–

 

Исследование околоплодных вод при физиологически протекающей беременности методом ПЦР-РВ дало следующие результаты. КВМ был адекватным у всех пациенток (10^4,73 ± 10^4,23 ГЭ/мл).

Из табл. 2 видно, что лабораторная ОБМ выше, чем рассчитанная ОБМ. Это касалось как для абсолютного количества ОБМ (ОБМл = 10^3,02Гэ/мл и ОБМр = 10^2,83 Гэ/мл), как и частоты выявления в целом. Лабораторная ОБМ присутствовала у 10 пациенток (52,6 %), а расчетная ОБМ получена только для 6 беременных (31,6 %). У 9 (47,4 %) беременных в околоплодных водах микроорганизмы выявлены не были (лабораторная ОБМ и расчетная ОБМ равны нулю), то есть околоплодные воды были стерильны. В 3 случаях (15,8 %) лабораторная ОБМ превышала расчетную, данную разницу мы склонны объяснить выявлением некой бактериальной массы, ДНК микроорганизмов которой не идентифицируются данным методом, так называемые «неизвестные» виды. Вероятно, в околоплодных водах могут быть презентированы совершенно иные микроорганизмы.

 

Таблица 2. Распределение микроорганизмов в околоплодных водах при доношенной беременности, определенное методом ПЦР-РВ

Признак	Частота случаев выявления, абс. (%)	Количество выявленного микроорганизма по отношению к ОБМл, M ± m, %	Абс., lg (М)
КВМ	19 (100)	–	4,73
ОБМ лабораторная (ОБМл)	10 (52,6)	100	3,02
ОБМ расчетная (ОБМр)	6 (31,6)	64,67 ± 1,47	2,83
Lactobacillus spp.	1 (5,3)	10,00 ± 0,93	2,02
Enterobacteriaceae spp.	4 (21,0)	37,15 ± 1,49	2,59
Streptococcus spp.	–	–	–
Staphylococcus spp.	1 (5,3)	5,01 ± 0,67	1,72
Gardnerella vaginalis + Prevotella bivia + Porphyromonas spp.	–	–	–
Eubacterium spp.	–	–	–
Sneathia spp. + Leptotrichia spp. + Fusobacterium spp.	–	–	–
Megasphaera spp.+Veillonella spp.+Dialister spp.	–	–	–
Lachnobacterium spp.+Clostridium spp.	–	–	–
Mobiluncus spp.+Corynebacterium spp .	2 (10,6)	12,02 ± 1,00	2,1
Peptostreptococcus spp.	–	–	–
Atopobium vaginae	1 (5,3)	0,48 ± 0,21	0,7
Candida spp.	–	–	–
Mycoplasma hominis	–	–	–
Ureaplasma (urealyticum + parvum)	–	–	–
Mycoplasma genitalium	–	–	–
Неизвестные виды	12 (63,1)	35,33 ± 1,48	2,56

 

По частоте выявления 4 (21,0 %) и абсолютному количеству (10^2,59 Гэ/образец) преобладали представители семейства Entero bacteriaceae spp., в соотношении с остальными видами – 37,15 ± 1,49 %.

Большинство микроорганизмов в околоплодных водах выявлены в единичных случаях и крайне низких титрах: Lacto bacillus spp., Staphylococcus spp., Mobiluncus spp. + Corynebacterium spp. и Atopobium vaginae (рисунок).

 

Рис. Относительная частота (%) (количество выявленного микроорганизма по отношению к лабораторной ОБМ) в околоплодных водах при физиологически протекающей беременности

 

На протяжении многих десятилетий преобладала устойчивая точка зрения, что фетоплацентарный комплекс в норме стерилен, и первый контакт новорожденного с микроорганизмами происходит во время родов [16, 25]. Применение новых методов исследования в микробиологии позволило изменить представления о микробиоте различных ниш, не только хорошо известных своим разнообразием (кишечник, влагалище и ротовая полость), но и тех локусов, которые всегда считались стерильными, и выявление в них каких-либо микроорганизмов интерпретировалось как инфицирование, например, амниотическая жидкость, полость матки и т.д. [26]. Появление методов амплификации генов и секвенирования ДНК сделали революционный прорыв метагеномики и позволили идентифицировать геном хозяина с обитающими микроорганизмами в различных локусах человеческого тела.

Ранее считалось, что выявление микроорганизмов в околоплодных водах возможно только при поврежденных плодных оболочках или с началом родовой деятельности [11]. Сейчас же все больше исследований демонстрируют наличие микроорганизмов в полости матки и плаценте при физиологически протекающей беременности без каких-либо негативных последствий в плане реализации материнской и перинатальной инфекции [5, 10, 19, 27, 28]. Доказано, что при неповрежденных плодных оболочках микроорганизмы могут проникать в полость амниона и культивироваться у здоровых матерей и их новорожденных как в амниотической полости, так и на фетальных мембранах и плаценте [29, 30, 31]. Исследования Combs et al. [30, 31] показали, что нет никакой связи между интраамниотической инвазией бактериями с преждевременными родами при отсутствии воспаления, критериями которого являются гистологический хориоамнионит и/или IL-6 более 11,3 нг/мл.

Микробный пейзаж в околоплодных водах характеризуется меньшим разнообразием по сравнению с другими составляющими фетоплацентарного комплекса. Так, в исследовании Lim et al. [12] анализ амниотической жидкости, собранной во время элективного кесарева сечения, продемонстрировал ее низкую обсемененность – 944 ± 374 Гэ/мл, что соответствовало очень низкой бактериальной массе. Исследователями сделан вывод, что в норме доношенный младенец внутриутробно не подвергается выраженному микробному воздействию накануне родов, определенная бактериальная масса в околоплодных водах все же может присутствовать. В нашем исследовании были получены сходные результаты: общая бактериальная масса составила 1071 ± 345 Гэ/мл при интактных плодных оболочках с небольшим диапазоном выявленных микроорганизмов.

В исследовании Collado M.C. [32] было выдвинуто предположение, что амниотическая жидкость содержит определенное микробное сообщество, которое впоследствии способствует формированию собственной микробиоты и иммунитета у новорожденного. Основным микроорганизмом, характерным для амниотической жидкости, был Proteobacteria, наиболее многочисленная группа бактерий – 1534 вида, что составляет примерно треть от всех известных видов бактерий [33]. Семейство Enterobacteriaceae spp. относится к данной группе бактерий, и его представители в нашем исследовании также были лидирующими как в абсолютном количестве (10^2,59 Гэ/мл), так и по частоте выявления (22,2 %).

По данным другого исследования, Propionibacterium, Bacillales spp., Anoxybacillus, Caulobacteraceae spp., Methylobacteriaceae spp., Methylobacterium, Phyllobacterium, Sphingomonas, Comamonadaceae spp., и Deinococcus являются наиболее характерными представителями в амниотической жидкости [19]. По данным литературы [19, 34] менее 1 % приходится на Streptococcus spp. и Staphylococcus spp. в околоплодных водах, в нашем исследовании эти семейства представлены тоже в единичных случаях. Lactobacillae spp. не являются типичным представителем амниотической жидкости – 1,15 % в исследовании M.C. Collado [19], в нашем исследовании данный представитель определился в одном случае (5 %).

Микробиологическая колонизация матки, околоплодных вод и плаценты играет важную роль, позволяя плоду проявлять толерантность к бактериям после рождения через феномен прайминга, поскольку происходит формирование врожденной экспрессии генов иммунной реакции у плода и в дальнейшем создание здорового микробиома у новорожденного [19, 35]. Наконец, возможно, что в норме амниотическая жидкость действительно не содержит жизнеспособные бактерии, и фактически обнаруженный микробиом – это высвобожденное ДНК микроорганизмов, происходящих из других локусов, например из крови или плаценты [10, 28]. Микробиомная структура околоплодных вод была достаточно разнообразна, но ОБМ была низкой, возможно, некоторая часть ДНК бактерий может гематогенно распространяться из крови в амниотическую полость [10, 26]. Данный взгляд может подтверждать и наше исследование, так как у 50 % обследованных околоплодные воды были стерильны.

Таким образом, во время физиологически протекающей беременности бактериальная колонизация амниотической полости возможна, однако детали и значение этого процесса еще предстоит выяснить.

Выводы

1. В норме общая бактериальная масса околоплодных вод низкая (ОБМ = 1071 ± ± 345 Гэ/мл).
2. При целом плодном пузыре наиболее характерными видами микроорганизмов, обитающими в амниотической жидкости, является Enterobacteriaceae spp. (37 %), остальные представлены в единичных случаях.
3. Наличие представителей анаэробного дисбиоза влагалища, а также лактобацилл не характерно при целых плодных оболочках.

About the authors

M. A. Kaganova

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: mkaganova@yandex.ru

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation

N. V. Spiridonova

Samara State Medical University

Email: mkaganova@yandex.ru

MD, PhD, Professor, Head of Department of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation

L. K. Medvedchikova-Ardiya

Samara Regional Clinical Hospital named after V.D. Seredavin

Email: mkaganova@yandex.ru

obstetrician-gynecologist

Russian Federation

References

Supplementary files