Продление жизнеспособности изолированных кожных эксплантатов путем воздействия их собственными преобразованными физическими полями: экспериментальное исследование

Полный текст

Введение

Проблема разработки новых методов, оптимизирующих регенеративные процессы в коже, продолжает оставаться актуальной в связи с потребностью в операциях восстановления дефектов кожных покровов различного происхождения, особенно возникших в результате тяжелой ожоговой травмы. В настоящее время не потерял актуальности хорошо зарекомендовавший себя метод свободной пересадки полнослойных кожных трансплантатов для закрытия обширных раневых дефектов кожи [1]. Однако при таком методе кожной пластики существует риск некроза трансплантатов в период врастания в них новых сосудов. Поэтому продолжаются поиски методов оптимизации выживаемости трансплантатов непосредственно после пересадки. С этой целью проводятся исследования факторов физической природы (электромагнитных, фотонных, акустических и др.), оптимизирующих восстановительную терапию ран. В экспериментах на животных показан положительный эффект низкоинтенсивного лазерного излучения при приживлении свободных кожных трансплантатов [2]. Однако при клиническом применении лазера отсутствует предсказуемость терапевтического успеха в восстановлении кожных ран [3]. В то же время появились экспериментальные работы на животных, свидетельствующие о возможности использования собственных отраженных излучений кожных покровов для улучшения их выживаемости в условиях нарушенной трофики [4]. Хорошо известно, что поверхность кожи человека испускает электромагнитные волны чрезвычайно низкой интенсивности в оптическом диапазоне спектра 300–800 нм – сверхслабое фотонное излучение (СФИ) [5, 6]. В научной литературе представлены убедительные данные о биорегуляторной роли эндогенных физических полей, генерируемых живыми клетками [7, 8], которые могут приводить к направленному изменению свойств и жизнедеятельности других клеток [9, 10]. Ряд экспериментальных [11] и клинических [12] исследований свидетельствуют о возможности использования оптических отражателей из различных материалов для стимуляции клеточной активности и улучшения регенераторной способности кожных тканей. Однако феномен воздействия на клеточную активность их аутоизлучений (отраженных или преобразованных) остается малоисследованным. Поэтому вопросы, связанные со стимулирующим влиянием собственных эндогенных полей дермальных тканей на их регенерацию, нуждаются в дальнейшем изучении.

Цель исследования – изучение влияния материалов с оптико-электрическими свойствами – полнослойных кожных эксплантатов при их изоляции от организма и полном прекращении трофики.

Материалы и методы исследования

Исследование было проведено в экспериментальной лаборатории ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской травматологии и ортопедии имени Г.И. Турнера» МЗ РФ на пяти кроликах породы шиншилла обоих полов в возрасте 5–6 месяцев с массой тела 2,2–2,5 кг. Проведение эксперимента было одобрено решением локального этического комитета центра и соответствовало международным и национальным нормативным актам обращения с лабораторными животными. Все манипуляции с животными осуществляли в условиях общей анестезии, для которой использовали смесь гидрохлорида тилетамина и гидрохлорида золазепама (золетлил 100, Vibrac, Франция). Дозировку для каждого животного подбирали индивидуально из расчета 15 мг/кг массы животного. Анестезию проводили путем внутримышечной инъекции.

У каждого животного в области спины выстригали шерсть, при этом остаточная длина волос составляла не более 1 мм. В асептических условиях производили иссечение полнослойного участка кожи в форме квадрата со сторонами 3,0×3,0 см, который разрезали на 9 фрагментов размерами 1,0×1,0 см. Полученные кожные эксплантаты для изоляции от внешней среды заворачивали в три слоя тонкой стерильной полиэтиленовой пленки толщиной 30 мкм. Затем их укладывали по одному в стеклянные чашки Петри с тонким слоем воды на текстолитовые подложки наружной поверхностью кверху.

Эксплантаты опытной группы были распределены по трем сериям (рис. 1, а, б).

 

Рис. 1. Схема взаимного расположения кожных эксплантатов при их термостатировании вблизи с преобразователями из: а – алюминиевой фольги; б – монокристалла кремния. Экраны изготовлены из светонепроницаемой черной бумаги и тонкого стекла

 

I серия: на наружную поверхность кожного эксплантата укладывали преобразователь, представленный материалом с оптико-электрическими свойствами: а) лист пищевой алюминиевой фольги размером 3,0×3,0 см и толщиной 20 мкм; б) монокристалл кремния размером 1,0×1,0 см и толщиной 0,5 мм.

II серия: помещали экран из плотной светонепроницаемой черной бумаги размером 5,0×5,0 см: а) между алюминиевой фольгой и эксплантатом; б) между монокристаллом кремния и эксплантатом.

III серия: помещали экран, изготовленный из тонкого покровного стекла для гистологических препаратов, размером 5,0×5,0 см и толщиной 150 мкм: а) между алюминиевой фольгой и эксплантатом; б) между монокристаллом кремния и эксплантатом.

Эксплантаты контрольной группы помещали в аналогичные условия в чашки Петри: без покрытия, с покрытием из черной бумаги и с покрытием из тонкого стекла.

Чашки Петри с эксплантатами как опытной, так и контрольной групп накрывали крышками для сохранения высокой влажности воздушной среды и выдерживали в термостате при температуре 37 °C в течение двух суток. Эксперименты повторяли пять раз.

После термостатирования кожные эксплантаты фиксировали в 10 % растворе Кайзерлинга, проводили через батарею спиртов восходящей крепости и заливали в парафин. Полученные в дальнейшем срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Гистологическое исследование кожных эксплантатов позволило оценить их выживаемость в баллах после термостатирования. При этом оценивали состояние следующих четырех структур кожи животного: слоя эпидермиса, волосяных фолликулов, слоя собственно дермы и мышечного слоя. В случае полной сохранности каждой из структур – ей давали оценку, соответствующую одному баллу, при частичном некрозе клеток снижали оценку до 0,5 балла, при полном некрозе клеток сохранность структуры оценивали как ноль баллов. Таким образом, максимальную сохранность жизнеспособности кожного эксплантата оценивали в 4 балла, при тотальном некрозе эксплантата его жизнеспособность составляла ноль баллов.

Достоверность различий полученных результатов оценивали с использованием критерия Стьюдента, пороговый уровень статистической значимости принимали при значении критерия p < 0,05.

Результаты и их обсуждение

В норме в образцах кожи кролика, взятых из области спины, отчетливо различается эпителиальный слой, представленный 3–4 слоями крупных клеток с хорошо прокрашивающимися ядрами. Видна отчетливая структура волосяных фолликулов с округлыми и овальными клетками. Собственно дерма богата коллагеновыми волокнами и соединительнотканными клетками. Мышечный слой представлен совокупностью поперечно-полосатых мышечных волокон с рыхлой соединительной тканью (рис. 2, а).

В контрольной группе кожных эксплантатов, независимо от их контакта с черной бумагой и стеклом, по истечении двух суток термостатирования определялись тяжелые явления дегенерации всех слоев: эпителиальный слой эпидермиса и собственно дерма и прилежащий мышечный слой были полностью некротизированы, сохранялись только контуры волосяных фолликулов. Окрашивающиеся ядерные элементы отсутствовали во всех слоях (рис. 2, б).

 

Рис. 2. Эксперимент: а – структура кожи кролика в норме. Ядра клеток эпителиального слоя, слоя собственно дермы и волосяных фолликулов хорошо прокрашены; б – структура кожных эксплантатов контрольной группы через два дня после термостатирования. Тотальный некроз волосяных фолликулов, эпителиального и собственно дермального слоев. Окраска гематоксилином и эозином, ув. × 100

 

В первой серии опытной группы после термостатирования кожных эксплантатов показатели их жизнеспособности были высокие и не имели значимых отличий от таковых в опытах с непосредственным контактом с преобразователями из алюминиевой фольги и кремния (таблица). При этом выявлялась хорошая сохранность структуры дермальных слоев эксплантатов. Эпителиальный слой сохранял свое строение, клетки волосяных фолликулов морфологически представлялись неизмененными, в собственно дерме имелось значительное количество соединительнотканных клеток, ядра которых были хорошо окрашены. Структура мышечного слоя в основном была сохранена: большинство мышечных волокон имели отчетливую поперечную исчерченность, содержали хорошо прокрашиваемые ядра. Однако у части образцов на отдельных участках были выявлены начальные признаки дистрофических изменений. Это проявлялось в уменьшении количества окрашивающихся ядерных элементов.

 

Показатели жизнеспособности (баллы) изолированных полнослойных кожных эксплантатов через двое суток термостатирования при различных условиях контакта с преобразователями

Условия контакта эксплантата с преобразователем	Опытная группа		Контрольная группа
	Преобразователь – алюминиевая фольга	Преобразователь – монокристалл кремния
I серия –непосредственный контакт	3,7 ± 0,12	3,8 ± 0,12	0,0 ± 0,00
II серия – через экран из черной бумаги	3,6 ± 0,10	3,7 ± 0,20
III серия – через экран из стекла	{0,2 ± 0,12}*	3,3 ± 0,30

Примечание: * – достоверно различающиеся показатели (р < 0,05) между группами в опытах с экранированием и без экранирования; { } – достоверно различающиеся показатели (р < 0,05) между группами в опытах с разными преобразователями.

 

После термостатирования кожных эксплантатов во второй серии с использованием экранов из светонепроницаемой черной бумаги показатели жизнеспособности дермальных тканей оставались высокими и не отличались значимо от результатов опытов первой серии (рис. 3, а).

 

Рис. 3. Структура кожных эксплантатов: а – во II серии в группе с их экранированием черной бумагой от алюминиевой фольги. Хорошая сохранность ядер клеток эпителиального слоя, слоя собственно дермы и волосяных фолликулов; б – в III серии в группе с их экранированием тонким стеклом от алюминиевой фольги. Некротизирование волосяных фолликулов, эпителиального и собственно дермального слоев. Окраска гематоксилином и эозином, ув. × 100

 

В третьей серии опытов наметилась тенденция к снижению витальности в группе эксплантатов при их экранировании от кристаллов кремния тонким стеклом. Хотя снижение показателя жизнеспособности эксплантатов оказалось незначимым, лишь в части образцов некротические процессы в их мышечном слое стали несколько более выраженными. Местами поперечная мышечная ткань эксплантатов была некротизирована: определялись только контуры волокон без исчерченности и ядер. Между мышечными волокнами имелись разложившиеся соединительнотканные клетки, в некоторых местах были видны остатки их ядер. Однако в группе эксплантатов, экранированных от алюминиевой фольги тонким стеклом, наблюдалось резкое снижение их витальности, что фактически означало гибель дермальных тканей. Во всех без исключения образцах выявлялись обширные некротические процессы с захватом всех слоев дермы. Определялись только единичные прокрашиваемые пикнотичные ядра на фоне некротизированных волосяных фолликулов (рис. 3, б).

В настоящее время хорошо известно, что клетки эпидермиса и дермы кожи человека продуцируют сверхслабое фотонное излучение [13], которое регистрируется также у тканевых кожных эксплантатов [14]. Высказываются гипотезы, предполагающие, что сверхслабый фотонный поток и когерентные сверхвысокочастотные (СВЧ) излучения, продуцируемые биотканями, могут дистанционно передавать информацию от одних клеток к другим [7, 15]. Однако такие умозаключения носят исключительно теоретический характер, поскольку на данный момент не существует доказанной биологической модели для объяснения этого феномена. В настоящей работе в опытах первой серии кожные эксплантаты, находящиеся вблизи алюминиевой фольги или монокристаллов кремния, при термостатировании хорошо сохраняли структуру дермальных тканей, несмотря на полное нарушение трофики. В связи с этим можно было бы предположить, что благоприятное воздействие на выживаемость эксплантатов могло оказать излучаемое ими же сверхслабое фотонное излучение, отраженное (возможно, с преобразованием спектра) от зеркальной металлической поверхности листа фольги или преобразованное кристаллическим кремнием. Однако в опытах второй серии при экранировании преобразователей от эксплантатов светонепроницаемой черной бумагой выявлена хорошая сохранность структуры кожных образцов. Указанный факт исключает, в первую очередь, гипотезу о ведущей роли собственного фотонного излучения эксплантатов в продлении их жизнеспособности, поскольку оптическое отражение от зеркальной поверхности фольги полностью экранировано. В третьей серии опытов при установке экранов из тонкого стекла между алюминиевой фольгой и эксплантатами в дермальных тканях последних при термостатировании развились выраженные некротические процессы. Логично было бы предположить, что стекло поглощает продуцируемые кожными эксплантатами физические поля. Действительно, работы других авторов подтверждают, что экраны из обычного стекла могут задерживать сверхслабые излучения клеток [16]. Однако в настоящем исследовании экранирование кристаллов кремния стеклом значимо не сказалось на жизнеспособности эксплантатов, что свидетельствует о хорошей проницаемости тонкого стекла для физических полей, продуцируемых взаимодействием эксплантатов с этими кристаллами.

Таким образом, в результате проведенных исследований достоверно установлен феномен благотворного влияния на выживаемость кожных эксплантатов их контакта с материалами, обладающими оптико-электрическими свойствами. Механизмы этого феномена нельзя объяснить процессами простого отражения или некоего преобразования собственных излучений эксплантатов. Видимо, в данном случае присутствуют более сложные, пока неизученные, оптико-электрические взаимодействия эксплантатов и преобразователей [17]. Предполагается, что у живых клеток наряду с оптическим путем передачи собственных сигналов существует акустический канал межклеточной коммуникации [18]. Также показана роль собственных акустоэлектрических колебаний клеток в поддержании и восстановлении их гомеостаза [19]. Имеется предположение, что эндогенные клеточные поля воздействуют на другие клетки не непосредственно, а на основе резонансных явлений [20]. Таким образом, установленный феномен активации дермальных клеток собственными физическими полями или излучениями пока остается не выясненным. В последние годы достоверно обнаружены эффекты воздействия структурных форм, таких как кристаллы, на процессы, протекающие в клетках организма человека – crystal-cell interactions [21, 22]. Кристаллические структуры оказывают стимулирующее влияние на регенерацию кожных покровов у животных [23]. Многие биоткани фактически моделируют свою структуру в соответствии с параметрами кристаллических решеток [24]. В коже человека наблюдаются резонансные процессы [25], дермальные ткани, благодаря входящему в их состав эпидермису, обладают свойствами фотонных кристаллов [26]. Сам эпидермис является источником электрических полей [27] с напряженностью 1 000 000 В/см [28]. В свою очередь кристаллический кремний, являясь полупроводником, способен, с учетом физики внутреннего кристаллического поля, преобразовывать внешние электромагнитные сигналы. Дистанционное взаимодействие эксплантатов с кристаллической структурой, приводящее к активизации метаболических процессов в дермальных тканях, возможно, найдет свое объяснение при рассмотрении его как следствия возникновения резонансов клеточных осцилляций с флуктуациями кристаллического поля кремния. Представленный в данной статье феномен повышенной жизнеспособности биотканей при их бесконтактном взаимодействии с некоторыми металлами и кристаллическими структурами известен не так давно, и в связи с его значимостью для трансплантологии и комбустиологии крайне нуждается в фундаментальных теоретических обоснованиях биофизических механизмов наблюдаемых явлений.

Выводы 

1. Проведенные эксперименты констатируют возможность длительной сохранности структуры дермальных тканей изолированных кожных эксплантатов с полным нарушением трофики при их термостатировании в условиях контакта с материалами, обладающими оптико-электрическими свойствами.
2. Повышение жизнеспособности эксплантатов может объясняться воздействием на них продуцируемыми ими же собственными физическими полями, преобразуемыми при взаимодействии с кристаллами кремния или алюминиевой фольгой. Механизмы этого взаимодействия пока неясны, существуют только предположительные гипотезы.
3. Дальнейшее изучение выявленных закономерностей может быть перспективным в аспекте инновационных разработок раневых покрытий на основе монокристаллов кремния или других подобных по свойствам нетоксичных, химически инертных материалов.
4. Освещенное в данной работе направление перспективно для применения в клинике с целью улучшения приживаемости пересаживаемых полнослойных кожных трансплантатов, что актуально при лечении глубоких ожоговых ран и других обширных поражений кожных покровов.

Об авторах

И. Е. Никитюк

Национальный медицинский исследовательский центр детской травматологии и ортопедии имени Г.И. Турнера

Автор, ответственный за переписку.
Email: femtotech@mail.ru

кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологических и биомеханических исследований

Россия, Санкт-Петербург

К. А. Афоничев

Национальный медицинский исследовательский центр детской травматологии и ортопедии имени Г.И. Турнера

Email: femtotech@mail.ru

доктор медицинских наук, руководитель отделения последствий травм и ревматоидного артрита

Россия, Санкт-Петербург

М. С. Никитин

Национальный медицинский исследовательский центр детской травматологии и ортопедии имени Г.И. Турнера

Email: femtotech@mail.ru

травматолог-ортопед отделения последствий травм и ревматоидного артрита

Россия, Санкт-Петербург

В. А. Кубасов

Научно-технический центр «Синтез» Научно-исследовательского института электрофизической аппаратуры имени Д.В. Ефремова

Email: femtotech@mail.ru

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории КЛ-3 БИ-3

Россия, Санкт-Петербург

В. В. Петраш

Медицинский университет «РЕАВИЗ»

Email: femtotech@mail.ru

доктор биологических наук, профессор кафедры медико-биологических дисциплин

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы