Изучение противовоспалительной активности и показателей острой токсичности новой серебряной соли пиразол-3-карбоксамида

Полный текст

Введение

Поверхностные микозы, вызываемые представителями дерматофитов, а также дрожжевыми грибами, являются важной проблемой здравоохранения, затрагивающей разные возрастные группы населения [1–4]. Для лечения данной патологии чаще используют препараты местного действия, которые наиболее востребованы на фармацевтическом рынке, на их долю приходится более 90 % продаж всех антимикотиков [5]. В связи с чем поиск новых соединений, обладающих противогрибковой активностью, которые потенциально могут быть использованы для местного лечения микозов, является актуальным направлением фармации. Наличие у вещества дополнительных фармакологических эффектов, таких как противовоспалительная активность, может способствовать ускорению процесса выздоровления при данной патологии.

Важнейшей характеристикой предполагаемой фармацевтической субстанции является отсутствие негативного влияния на организм, которое отражают такие показатели, как острая токсичность, раздражающее действие.

Цель исследования – изучение противовоспалительной активности и некоторых токсикологических показателей нового производного пиразол-3-карбоксамидов SSP.

Материалы и методы исследования

Осуществляли оценку биологической активности новой серебряной соли пиразол-3-карбоксамида SSP, проявившей высокую противогрибковую активность в планктонной культуре (pMIC₅₀1,0 мг/л, pMIC₉₀ 15,6 мг/л) и биопленке (sMIC₅₀ 11,8 мг/л)1 [6]. Исследования проводили в экспериментах на животных, полученных из питомника «Андреевка» Московской области. Содержание животных отвечало правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ № 199н от 01.04.2016 «Правила надлежащей лабораторной практики», а также положениям руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств [7]. Проведенные исследования одобрены комиссией по биоэтике ФГБОУ ВО ПГФА МЗ РФ (протокол № 7 от 20.01.2023).

В качестве эталонных препаратов были использованы мазь для наружного применения «Индометацин» производства ПАО «БИОСИНТЕЗ» (Россия), нимесулид производства ООО «Озон» (Россия) и нистатин производства ПАО «БИОСИНТЕЗ» (Россия).

Определение острой токсичности соединения при накожном нанесении осуществляли согласно руководству Р 1.2.3156-13 «Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека»2. Исследование включало эксперименты на грызунах (крысах). Животных распределяли по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по весу тела (± 10 %).

Исследуемый препарат в виде суспензии в диметилсульфоксиде и препарат сравнения наносили на кожу в области спины с помощью дозатора в влзрастающих дозах по Литчфилду – Уилкоксону. За 24 ч до начала эксперимента в месте нанесения препаратов у животных удалялась шерсть. Контрольным животным на кожу наносили разбавитель, в качестве которого был использован диметилсульфоксид. Дозирование осуществляли по общей массе образца. Для исследования каждой дозы препарата использовались группы по пять животных одного пола. Кроме того, имелись аналогичные по численности группы контрольных животных, которым таким же путем наносили препараты сравнения в объеме, эквивалентном максимальной испытанной дозе препарата.

Наблюдения за животными проводились в течение 14 суток с начала эксперимента. При этом регистрировались летальность, время гибели животных, симптоматика отравления, осуществлялись ежедневное наблюдение общего состояния и поведения, взвешивание, оценка потребления корма и воды. Погибшие животные подвергались вскрытию и макроскопическому исследованию. Через 14 суток все пережившие интоксикацию животные были подвергнуты эвтаназии в СО₂-камере и вскрыты. Были проведены макроскопическое описание и определение массовых коэффициентов внутренних органов, гистологические исследования.

Противовоспалительную активность определяли на нелинейных белых крысах массой 180–250 г, обоего пола, половозрелых – на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением в заднюю лапу крысы 0,1 мл 1 % водного раствора каррагенина при разных путях введения в организм [7]. Исследуемое соединение в виде суспензии в диметилсульфоксиде в количестве 0,5 мл наносили на кожу стопы крыс первой группы за 1 ч до введения флогогенного агента. Второй группе животных исследуемый объект вводили перорально в дозе 50 мг/кг за 1 ч до введения каррагенина.

Контролем служили животные, не получавшие препарата. Увеличение объема стопы, свидетельствующее о развитии отека, оценивали онкометрически через 3 ч после введения флогогенного агента, то есть на пике формирования отека. О наличии противовоспалительного действия судили по выраженности торможения воспалительной реакции по отношению к контрольному уровню. Если этот показатель был больше 30 %, результат учитывался как положительный.

Местно-раздражающее действие препарата изучали в экспериментах на нелинейных белых крысах массой 180–210 г, обоего пола, половозрелых – при накожном нанесении3. Исследуемое вещество помещали в количестве 0,5 г в виде пасты на предварительно депилированный участок кожи площадью около 6 см². Эти участки кожи прикрывали марлей, прикрепляя с помощью лейкопластыря. Период воздействия продолжался 4 ч, после чего вещество удалялось. Оценку раздражающего действия осуществляли в течение 14 дней. Выраженность раздражающего действия оценивали по степени эритемы, величине отека (толщине кожной складки в месте аппликации) и увеличению местной температуры кожи. Степень эритемы оценивали с помощью колориметрических линеек С.В. Суворова в баллах. Толщину кожной складки измеряли при помощи толщинометра ТР-1-10 в миллиметрах. Температура кожи измерялась электротермометром. Контролем служили животные, которым таким же образом наносили препарат сравнения.

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью пакета программ Statistica 8.0. Результаты обработаны способом вариационной статистики по методу Фишера – Стьюдента [8].

Результаты и их обсуждение

Оценка острой токсичности соединения SSP и препарата сравнения нистатина при накожном нанесении крысам показала, что ЛД₅₀ обоих веществ составила более 2500,0 мг/кг. Полученные данные свидетельствуют, что половых различий в показателях острой токсичности у них не проявляется. Летальных эффектов при нанесении на кожу достичь не удалось. Использование сравниваемых соединений в дозах выше 2500,0 мг/кг практически не представлялось возможным.

Таким образом, по показателям острой токсичности соединение SSP и препарат сравнения нистатин являются практически эквивалентными (эквитоксичными). Клиническая картина интоксикации при их однократном использовании в максимально возможных количествах характеризуется отсутствием признаков токсического действия, изменения общего состояния и поведения животных. Видовых и половых различий в течении интоксикации не отмечено. Клиническая картина интоксикации, вызванной обоими сравниваемыми препаратами, является одинаковой.

Результаты измерения массы тела животных, переживших интоксикацию при накожном нанесении препаратов в максимальных дозах, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1

Влияние сравниваемых препаратов на массу тела (г) крыс после однократного накожного нанесения, М ± m

Время наблюдения	Экспериментальная группа и пол
	«Контроль»		«SSP»		«Нистатин»
	самцы	самки	самцы	самки	самцы	самки
Фон	176,9 ± 4,0	175,8 ± 1,9	171,6 ± 3,6	177,0 ± 2,7	173,9 ± 3,4	179,2 ± 3,4
2-й день	179,9 ± 3,3	179,4 ± 3,0	173,3 ± 3,2	172,9 ± 3,1	168,6 ± 3,7	176,1 ± 3,5
7-й день	187,1 ± 4,2	188,2 ± 3,2	189,3 ± 5,4	186,6 ± 3,3	183,6 ± 4,7	187,4 ± 2,8
14-й день	193,9 ± 4,4	199,6 ± 3,6	193,4 ± 5,2	195,5 ± 2,8	191,7 ± 3,4	196,5 ± 2,7

 

Динамика массы тела опытных животных во всех группах существенно не отличается от контрольных данных. Статистически значимых отклонений массы тела животных в группах, получавших сравниваемые препараты, не наблюдается.

Все животные, пережившие интоксикацию, а также животные контрольной группы были подвергнуты эвтаназии СО₂-камере в конце исследования. Внешний осмотр крыс, умерщвленных через 14 дней после начала опыта, не выявил каких-либо существенных отличий опытных животных от контрольных. Все крысы нормального телосложения, средней упитанности. Шерстный покров блестящий, опрятного вида, очагов облысения не наблюдается. Выделения из естественных отверстий отсутствуют. Видимые слизистые оболочки бледные, блестящие, гладкие. По данным вскрытия и макроскопического исследования накожное нанесение сравниваемых препаратов в исследуемых дозах крысам обоих полов не вызывает видимых изменений внутренних органов, в том числе эндокринных желез, слизистых желудка и кишечника, а также головного мозга. В ходе гистологического исследования было установлено, что в материале кожи и мягких тканей лабораторных животных отмечаются фокусы очагового слущивания эпидермиса с кератином, что является следствием механического воздействия в рамках эксперимента. Воспалительно-клеточная инфильтрация в подлежащей дерме в участках слущивания эпидермиса не выявляется во всех исследованных образцах. Единичные периваскулярные мононуклеары дермы являются нормальными неизмененными элементами лимфоидной ткани, ассоциированной с кожей (SALT-структурами). Дистрофических, альтеративных и воспалительных изменений в печени и почках лабораторных животных не выявлено. Очаговые расстройства кровообращения в виде полнокровия капилляров почек, печени – это проявления перераспределения крови в агональном периоде. Полученные данные позволяют отнести соединение SSP к 5-му классу практически нетоксичных веществ (ГОСТ 32419-2022 «Международный стандарт. Классификация опасности химической продукции. Общие требования»).

Результаты исследования противовоспалительной активности соединения представлены в табл. 2 и 3.

 

Таблица 2

Противовоспалительная активность серебряной соли пиразол-3-карбоксамида при накожном нанесении, М ± m

Вещество	Прирост объема стопы через 3 ч, %	Торможение реакции через 3 ч, %
Суспензия SSP	94,32 ± 7,48, р = 0,220, р' = 0,005	10,0
Мазь «Индометацин»	13,7 ± 1,7, р = 0,001	86,9
Контрольная группа	104,8 ± 12,1

Примечание: р – уровень статистической значимости в сравнении с контрольными данными; р' – уровень статистической значимости в сравнении с мазью «Индометацин».

 

Таблица 3

Противовоспалительная активность серебряной соли пиразол-3-карбоксамида при пероральном введении, М ± m

Вещество	Прирост объема стопы через 3 ч, %	Торможение реакции через 3 ч, %
SSP	103,1 ± 9,9, р = 0,845, р' = 0,001	1,65
Нимесулид	39,2 ± 2,9, р = 0,001	62,59
Контрольная группа	104,8 ± 12,1

Примечание: р – уровень статистической значимости в сравнении с контрольными данными; р' – уровень статистической значимости в сравнении с нимесулидом.

 

Введение флогогенного агента животным вызывает значительное увеличение объема стопы к третьему часу наблюдения, прирост достигает 104,8 %, этот показатель был принят за контрольную величину. Использование такого лекарственного средства, как мазь «Индометацин», которая успешно применяется в практической медицине в качестве противовоспалительного средства, показало, что нарастание каррагенинового отека статистически значимо снижается, по сравнению с контрольными данными, до 13,7 %, то есть торможение воспалительной реакции достигает 86,9 %. Предварительное нанесение на кожу стопы крыс исследуемого вещества вызывает торможение воспалительной реакции, по сравнению с контрольными данными, лишь на 10 %, что не является статистически значимым результатом (p > 0,05).

При исследовании активности веществ при их пероральном введении было установлено, что под действием препарата сравнения нимесулида нарастание каррагенинового отека статистически значимо тормозится, по сравнению с контрольными данными. Прирост объема стопы у крыс составляет 39,2 % (р < 0,001), то есть торможение реакции достигает 62,59 %. При этом исследуемое соединение SSP не проявляет противовоспалительной активности, нарастание воспалительного отека к третьему часу эксперимента идет с той же интенсивностью, что в контрольных опытах.

В ходе изучения биологической активности соединения SSP особое значение имело исследование местно-раздражающего действия вещества. Его оценивали по степени эритемы, величине отека (толщине кожной складки в месте аппликации) и увеличению местной температуры кожи. Результаты исследования представлены в табл. 4–6.

 

Таблица 4

Толщина кожной складки у крыс после накожного применения, М ± m

Группа	Толщина кожной складки в области введения препарата, мм
	Сроки исследования, сут
	Контроль	1-е	3-е	5-е	14-е
«SSP»	3,3 ± 0,2	3,4 ± 0,2	3,5 ± 0,3	3,5 ± 0,4	3,4 ± 0,2
«Нистатин»	3,4 ± 0,3	3,5 ± 0,3	3,6 ± 0,2	3,6 ± 0,3	3,4 ± 0,3

 

Таблица 5

Местная температура кожи у крыс после накожного применения, М ± m

Группа	Местная температура, tºC
	Сроки исследования, сут
	Контроль	1-е	3-е	5-е	14-е
«SSP»	37,6 ± 0,5	37,8 ± 0,5	37,7 ± 0,4	37,7 ± 0,6	37,7 ± 0,4
«Нистатин»	37,5 ± 0,3	37,5 ± 0,4	37,6 ± 0,3	37,8 ± 0,3	37,5 ± 0,3

 

Таблица 6

Выраженность эритемы кожи у крыс после накожного применения

Группа	Степень эритемы в баллах
	Сроки исследования, сут
	Контроль	1-е	3-е	5-е	14-е
«SSP»	0	1	0	0	0
«Нистатин»	0	0	0	0	0

 

При накожной аппликации соединения SSP и нистатина не происходит увеличения толщины кожной складки. Таким образом, установлено, что препараты не вызывают развития отека.

При применении соединения SSP и нистатина температура участков кожи на месте нанесения не повышается. Статистически значимых отличий показателей от контрольных данных (при р < 0,05) не отмечено.

Анализ степени эритемы показал, что в целом при использовании как нистатина, так и соединения SSP она оценивается как нулевая, то есть отсутствует.

Выводы

1. Полученные данные позволяют отнести новую серебряную соль пиразол-3-карбоксамида SSP к 5-му классу практически нетоксичных веществ.
2. Соединение SSP не проявляет местно-раздражающего действия.
3. Изучаемая серебряная соль пиразол пиразол-3-карбоксамида не проявляет противовоспалительной активности на модели каррагенинового воспаления.

 

1 Гейн В.Л., Бобровская О.В., Русских А.А., Новикова В.В., Махмудов Р.Р. Патент Российской Федерации 2763724 (2021). Бюлл. № 1.

2 Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека: руководство. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 2014; 639 (утв. 27.12.2013).

3 Марченко Е.Н., Дымова Е.Г., Молодкина Н.Н. [и др.] Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи: (метод.указания). МЗ СССР. М. 1980; 23.

Об авторах

Ирина Павловна Рудакова

Пермская государственная фармацевтическая академия

Автор, ответственный за переписку.
Email: rudakova.i@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-2227-8313

доктор медицинских наук, доцент, заведующая кафедрой физиологии

Россия, г. Пермь

В. В. Новикова

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: rudakova.i@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-4475-4421

доктор фармацевтический наук, доцент, заведующая кафедрой микробиологии

Россия, г. Пермь

О. В. Бобровская

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: rudakova.i@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-3394-9031

доктор фармацевтический наук, доцент, профессор кафедры фармацевтической химии

Россия, г. Пермь

В. Л. Гейн

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: rudakova.i@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-8512-0399

доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой общей и органической химии

Россия, г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы