Functional role of genes in ROH sites in Czech Golden chickens

Full Text

Одомашнивание кур сопровождалось селекцией, способствующей выведению большого разнообразия пород, которые отличаются по генотипу и фенотипу. Следовательно, кур можно считать идеальной моделью для генетических исследований о влиянии селекции на инбридинг и выявление генов, находящихся в районах, затронутых инбридингом. Инбридинг приводит к образованию протяженных гомозиготных последовательностей SNPs (ROH) в хромосомах животных. С появлением современных технологий (чипы, позволяющие обнаружить однонуклеотидный полиморфизм (SNP) в геноме животных) стало возможным идентифицировать в хромосомах ROH сегменты. Предложено несколько вариантов программного обеспечения сканирования генома животных для выявления ROH сегментов. [16] Такие исследования проведены у многих видов сельскохозяйственных животных. [14] На практике используют два подхода для сканирования генома – последовательное и заданной рамкой. Для обнаружения ROH у кур породы Чешская Золотистая (ЧЗ) мы применяли метод последовательного сканирования генома, так как он позволяет идентифицировать больше ROH сегментов. В результате продолжительного интенсивного инбридинга формируются ROH островки, в которых одни и те же ROH последовательности встречаются у многих животных. Анализ генов, расположенных в ROH островках, может свидетельствовать о функциональном направлении селекции породы кур.

Цель работы – изучить функции генов в ROH островках у кур породы Чешская Золотистая.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использовали 16 куриц породы Чешская Золотистая (ЧЗ), случайно отобранных из популяции, находящейся в генетической коллекции редких и исчезающих пород (ВНИИ генетики сельскохозяйственных животных, Санкт-Петербург). Порода ЧЗ была завезена в Россию из Чехии в 1977 году. Легкая, активная и подвижная птица с оперением цвета куропатки и грифельными ногами, относится к яичному типу. Яйценоскость за 52…56 недель жизни – 150…170 яиц. Масса яйца после 52 недели – 55…56 г. Живая масса курицы – 1,4…1,6 кг, петуха – 2,0…2,3 кг.

Куры были генотипированы чипом Illumina Chicken 60KSNP iSelect Bead Chip. Работали только с аутосомами. Контроль качества генотипирования осуществляли с помощью программного обеспечения PLINK 1.9. [15] На первом этапе были удалены SNPs с показателем качества (QS) менее 0,7, затем в SNPs данных оставили не более 5% негенотипированных SNPs, также удалили SNPs с минорной частотой аллелей (MAF) < 0,01. В результате проведения контроля качества было получено 53780 SNPs.

ROH сканирование генома кур осуществлено программой detectRUNS со следующими параметрами: последовательные прогоны по аутосомам выполняли с 20 SNP; минимальный размер ROH сегментов – 250 т.п.н.; максимальное расстояние между ROH сегментами – 1 Мб. [1] Программа позволяет выявлять ROH островки. При их обнаружении гетерозиготные SNP в ROH сегментах были запрещены. В ROH островках идентичные ROH сегменты встречались у 90% кур.

Ранг хромосом вычисляли по формуле:

$Ранг хромосом{ы}_i=\frac{{\displaystyle \frac{количество ROH в хромосоме \left(i\right)}{сумма всех ROH}}}{{\displaystyle \frac{длина хромосомы \left(i\right)}{сумма длин 28 хромосом}}}.$

По данным ROH рассчитывали коэффициент инбридинга:

$F_{ROH} = L_{ROH} / L_{геном},$

где L_ROH – суммарная длина сегментов ROH в геноме каждой курицы; L_геном – совокупная длина аутосом курицы покрытых SNPs.

Гены, расположенные в ROH островках, были идентифицированы из браузера Ensembl BioMart. [4] Данные транскрипционной активности – TPM в тканях курицы получали в программе GalBase. [7] Транскрипты на миллион (TPM) – метод нормализации РНК последовательностей, свидетельствующий об интенсивности транскрипции гена. Функции генов определяли из статей в PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/) и Google Академия (https://scholar.google.com/).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По данным ROH сканирования генома кур было выявлено среднее количество 143 ± 8ROH сегментов на курицу при условии запрета в них гетерозиготных SNP (табл. 1). Если допускался один гетерозиготный SNP, то среднее количество ROH сегментов увеличивалось до 181 ± 8, если два, то –232 ± 8. Допущение даже одного гетерозиготного SNP в ROH сегментах приводит к достоверному увеличению среднего количества ROH. Такой результат может привести к переоценке данных, так как в случае допущения гетерозиготных SNPs объединяются короткие (250…500 т.п.н.) гомозиготные ROH сегменты, которые не всегда аутозиготные. Среднее значение количества ROH сегментов (143 ± 8) для кур породы Чешская Золотистая значительно превышает этот показатель у других пород сохраняемых в коллекции ВНИИГРЖ – Амрокс (18,9 ± 1,5), Брама палевая (36,6 ± 2,1), Корниш белый (40,4 ± 1,1), Леггорн светло-коричневый (47,5 ± 2,3), Пушкинская (68,3 ± 2,0), Суссекс светлый (23,1 ± 1,5). [5] Увеличенное количество ROH сегментов, обнаруженное у кур породы Чешская Золотистая, приводит к большому коэффициенту инбридинга.

 

Таблица 1. Количество ROH сегментов в зависимости от числа разрешенных гетерозиготных SNP в ROH

Значение ROH*	Гетерозиготные SNP запрещены	Разрешен один гетерозиготный SNP	Разрешено два гетерозиготных SNP
Среднее	143 ± 8	181 ± 8	232 ± 8
Максимальное	202	246	289
Минимальное	88	118	170

Примечание. * – число кур 16.

 

В таблице 2 представлены данные о количестве ROH сегментов, находящихся в разных классах длин. При допущении даже одного гетерозиготного SNP в ROH сегментах значительно увеличивается количество ROH сегментов в самом коротком классе длин– 0,25…2,0 м.п.н. Таким образом, такое допущение может привести к появлению в данных не аутозиготных ROH сегментов, то есть не обусловленных селекцией ROH.

 

Таблица 2. Количество ROH сегментов в пяти классах длин у 16 кур породы ЧЗ

Класс длин (м.п.н.)	Гетерозиготный SNP в ROH сегментах запрещен	Разрешен один гетерозиготный SNP в ROH сегментах
0,25...2,0	1667	2264
2...4	357	357
4...8	178	178
8...16	67	76
>16	24	27

 

На рисунке представлено распределение кур в зависимости от соотношения суммарной длины ROH сегментов к их количеству. Наблюдается различие (более чем в два раза) как по суммарной длине, так и количеству ROH сегментов в хромосомах. По этим показателям паттерна ROH сегментов только шесть кур (центральная область рисунка) имеют близкие значения.

 

Распределение кур по соотношению суммарной длины и количеству ROH сегментов

 

Ранг хромосомы, вычисленный как отношение доли ROH сегментов в хромосоме к доле длины хромосомы в геноме, представлен в таблице 3. Он свидетельствует о плотности заполнения хромосомы ROH сегментами. В основном микрохромосомы (с номером < 10) более других заполнены ROH сегментами. Частота рекомбинации в микрохромосомах в 2,8 раза больше, чем в макрохромосомах. [12] В хромосоме 16 с наименьшей плотностью заполнения ROH сегментами расположены гены ответственные за иммунитет, включая комплекс гистосовместимости. [13] Аллели этих генов имеют тенденцию к гетерозиготности. Возможно, это объясняет наименьшее число ROH сегментов в хромосоме.

 

Таблица 3. Ранг хромосом у кур породы ЧЗ

Хромосома	25	23	22	27	26	17	20	28	11	19
Ранг	0,874	0,853	0,823	0,739	0,667	0,643	0,625	0,601	0,590	0,511
Хромосома	24	18	21	12	10	15	7	6	9	14
Ранг	0,504	0,460	0,425	0,414	0,406	0,397	0,385	0,369	0,350	0,349
Хромосома	8	13	1	2	4	3	5	16
Ранг	0,341	0,317	0,292	0,266	0,265	0,260	0,260	0,110

 

Коэффициент корреляции между долей количества ROH сегментов в хромосоме от их общего числа в 28 хромосомах и долей длины хромосомы от их суммарной длины характеризует тип заполнения хромосом ROH сегментами. Рассчитанная корреляция по Пирсону составляет 0,99 (Р = 8,8Е-23), Спирмену – 0,94 (Р = 2,0Е-7). Такие высокие значения коэффициента корреляции свидетельствуют об общей тенденции к случайному распределению ROH сегментов в 28 хромосомах кур. Хромосома 16 – исключение из общей закономерности.

Средний коэффициент инбридинга у кур породы ЧЗ равен 0,34 ± 0,03. Такой результат может быть следствием малочисленности ЧЗ популяции кур, сохраняемой в генетической коллекции редких и исчезающих пород ВНИИГРЖ. Для сравнения средний коэффициент инбридинга у других пород из коллекции ВНИИГРЖ: Амрокс – 0,105 ± 0,009, Брама палевая – 0,167 ± 0,015, Корниш белый – 0,055 ± 0,007, Леггорн светло-коричневый – 0,167 ± 0,011, Пушкинская – 0,112 ± 0,009, Русская белая – 0,307 ± 0,014, Суссекс светлый – 0,127 ± 0,003. [5]

В хромосомах GGA2, GGA3, GGA9 и GGA22 были найдены четыре ROH островка. Их длина (93…403 т.п.н.) характерна для многих пород кур. [19, 21]

В хромосоме GGA2 в районе 143452130 ... 143696199 п.н. расположен ROH островок, включающий ген альфа последовательность коллагена типа XXII (COL22A1). Наибольшая транскрипционная активность этого гена обнаружена в проксимальной передней конечности, TPM = 36, коже – 32 и сетчатке глаз, TPM = 37. [7] Он был ассоциирован с целостностью тканей и клеточной адгезией. Считают, что у людей мутации в гене COL22A1 могут приводить к фиброзу легких и кожи. [22]

В хромосоме GGA3 (район 61542241 ... 61634781 п.н.) есть ROH островок, включающий ген TBC1 домен член семейства 32 (TBC1D32). Наибольшая транскрипционная активность обнаружена в мозге, ТРМ = 24, семенниках – 27, сетчатке глаз – 37, эмбрионе – 37 и голени, ТРМ = 37. [6] У ресурсных кур в F2 поколении ген TBC1D32 был ассоциирован с весом сумки Фабрициуса. [18]

Еще один ген ENS1 (другое название ядерный сигнал 1 для эндоплазматического ретикулума (ERNI)) тоже находится в этом ROH островке. Установлено, что он экспрессирует в эмбриональных яичниках и семенниках кур, а также в эмбриональных стволовых клетках. По мере дифференцировки стволовых клеток экспрессия гена ENS1 уменьшается. [9]

В хромосоме GGA9 (17727833…17952104 п.н.) расположен ROH островок с геном Х-сцепленный рецептор 1 трансдукции бета 1 (TBL1XR1). Наибольшая транскрипционная активность гена обнаружена в сумке Фабрициуса, ТРМ = 118 и голени, ТРМ = 77. [7] У кур породы Ghana он был ассоциирован с иммунным ответом на заражение вирусом болезни Ньюкасла. [20] У человека ген TBL1XR1 связан с множественными нарушениями развития и несколькими неврологическими проявлениями. [11]

В хромосоме GGA22 (454878…516797 п.н.) найден ROH островок, включающий несколько генов. Один из них переносчик растворенного вещества семейства 23, члена 2 (SLC23A2) – трансмембранный транспортер. Он максимально транскрибируется в мозге, ТРМ = 146, сетчатке глаз – 106 и голени, ТРМ = 122. [7] Известно, что ген SLC23A2 влияет на пигментацию пера у китайских пород кур. [8]

Другой ген Ras ассоциированный домен, член семейства 2 (RASSF2) максимально транскрибируется в коже, ТРМ = 177, селезенке – 195 и сумке Фабрициуса, ТРМ = 184. Этот ген у человека – супрессор рака легкого, у мышей – регулирует дифференцировку остеобластов и остеокластов, ингибируя передачу сигналов NF-κB. [3, 17]

Еще один ген прионный белок (PRNP) расположен в этом ROH островке. Его максимальная транскрипционная активность наблюдается в мозжечке, ТРМ = 752. Прионные заболевания были зарегистрированы у нескольких млекопитающих-хозяев, но у кур обнаружена устойчивость к экспериментальной прионной инфекции. Установлено, что у перепела ген PRNP регулирует деградацию нейронов. [10]

Неклассические гены теплового шока служат для защиты клеток от вредных стрессов. Ген проминин 2 (PROM2) участвует в регуляции таких генов у мышей и кур. [6] Его максимальная транскрипционная активность наблюдается в фолликулах, ТРМ = 293. Еще один ген в этом ROH островке – дигидропиримидиназа 2 (DPYSL2), участвует в формировании ожирения у кур. [2] Его максимальная транскрипция в мозге, ТРМ = 1250.

ROH островки можно рассматривать как индикаторы обусловленного селекцией инбридинга. У кур породы ЧЗ находятся гены ответственные за иммунитет (TBL1XR1), вес сумки Фабрициуса (TBC1D32), ожирение (DPYSL2), пигментацию пера (SLC23A2), регуляцию «хит шоковых» генов (PROM2) и деградацию нейронов (PRNP). Таким образом, перечисленные выше признаки были затронуты селекцией у кур породы ЧЗ. Исходя из данных в опубликованных статьях, ROH островки у кур других пород не совпадают по локализации с найденными в нашем исследовании, что свидетельствует об их уникальности для Чешской Золотистой породы кур.

Выводы. В геноме кур породы ЧЗ выявлены ROH сегменты. Среднее количество ROH на курицу – 143 ± 8. Установлена тенденция случайного распределения ROH сегментов в хромосомах кур. Коэффициент инбридинга, вычисленный исходя из ROH данных, оказался высоким (0,34 ± 0,03), по сравнению с другими породами, сохраняемыми в коллекции ВНИИГРЖ. В хромосомах кур GGA2, GGA3, GGA9 и GGA22 обнаружены ROH островки. Гены, локализованные в них, участвуют в иммунитете, деградации нейронов, степени ожирения птицы и пигментации пера.

About the authors

M. G. Smaragdov

Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding – Branch of the l.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry

Author for correspondence.
Email: spbvniigen@mail.ru

PhD in Biological Sciences

Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files