Особенности лабораторной диагностики моноцитарного эрлихиоза человека

Полный текст

Введение

На территории Предуралья к наиболее часто встречающимся инфекциям, передающимся иксодовыми клещами, относят клещевой энцефалит (КЭ), иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ), гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) и моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) [1–5].

Первый случай моноцитарного эрлихиоза человека был выявлен в США в 1986 г. В последующие годы установлены основные этиологические агенты этого заболевания – Ehrlichia chaffeensis и Ehrlichia muris [6]. При этом Ehrlichia chaffeensis встречается в основном в странах Европы, Северной Америки, Африки и Восточной Азии, а в Российской Федерации распространены очаги Ehrlichia muris [7]. На территории Пермского края генетический материал Ehrlichia muris был впервые обнаружен в клещах Ixodes persulcatus в 1997 г., а уже в следующем году впервые в России у пациентов Пермского края были выявлены случаи заболевания МЭЧ с помощью непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ) [8–10].

Ввиду общего механизма заражения возбудителями МЭЧ и других инфекций, передающихся иксодовыми клещами, нередко происходит развитие разнообразных смешанных заболеваний [11–13]. В связи с этим клиническая диагностика в остром периоде «клещевых» инфекций значительно затруднена, а на первое место в верификации заболеваний выступает лабораторная диагностика [14].

До настоящего времени наиболее часто для диагностики этих заболеваний используют серологические методы, преимущественно иммуноферментный анализ (ИФА) и НРИФ [8, 15]. Однако, по результатам многолетних исследований, проведенных в США, эффективность серологических тестов в диагностике МЭЧ остается недостаточно высокой (до 74–89 %) [16, 17]. В случаях серонегативного МЭЧ только благодаря молекулярно-генетическому методу удается подтвердить правильный диагноз. Даже при положительных серологических результатах часто не удается подтвердить диагноз в остром периоде заболевания, поскольку антитела (до 80 % случаев) определяются лишь со второй недели инфекционного процесса [17], что препятствует своевременному назначению терапии.

На современном этапе значимыми преимуществами для подтверждения МЭЧ обладает один из наиболее широко используемых тестов молекулярной диагностики – полимеразная цепная реакция (ПЦР). Она позволяет не только осуществлять детекцию ДНК эрлихий в остром периоде заболевания, но и идентифицировать его возбудителя до геновида, а также осуществлять лабораторную диагностику микст-инфекций [12, 18]. В настоящее время в странах Запада ПЦР, обладающая сравнительно высокой чувствительностью (до 60–85 %), широко используется для подтверждения диагноза МЭЧ. Ее рекомендуют использовать не как замену серодиагностики, а как неотъемлемый дополнительный метод, способный значительно улучшить верификацию заболевания [16, 17, 19].

Цель исследования – на примере данных, полученных в Пермском крае, выявить эффективность применения ПЦР-метода для диагностики моноцитарного эрлихиоза человека в разные сроки от начала заболевания, а также с помощью ПЦР и ИФА определить роль МЭЧ в структуре инфекций, передающихся иксодовыми клещами.

Материалы и методы исследования

За четырехлетний период в Пермскую краевую клиническую инфекционную больницу (ГБУЗ ПК ПККИБ) поступили 583 пациента с острыми лихорадочными заболеваниями (ОЛЗ), развившимися после присасывания клещей, причем большинство больных (437 человек, или 74,9 %) – в первые 7 дней от начала заболевания. Среди них было 274 женщины и 309 мужчин в возрасте от 15 до 84 лет.

Все больные были тщательно обследованы клинико-эпидемиологически, включая получение анамнестических данных, оценку объективного статуса, проведение лабораторных общеклинических исследований (общий анализ крови, анализ мочи, биохимический анализ крови с определением показателей функций печени и почек, ЭКГ), по показаниям выполнены спинномозговая пункция с исследованием ликвора, УЗИ органов брюшной полости. Обследование при необходимости проводили совместно с неврологом, кардиологом, дерматологом, окулистом. При сборе анамнеза особое внимание обращали на сведения о присасывании клещей, пребывании в лесу, употреблении коровьего или козьего некипяченого молока в сроки, соответствующие инкубационному периоду «клещевых» инфекций.

От 251 пациента в первые 50–60 дней от начала заболевания для исследования ПЦР-методом были трехкратно взяты пробы цельной крови из локтевой вены в количестве 1 мл в пробирки Eppendorf, содержащие антикоагулянт EDTA. От каждого пациента было получено как минимум по две пробы (первую брали при поступлении пациента в стационар, вторую через 10–14 дней после первой). У 132 пациентов также была взята третья проба через 30 дней и более после второй, за исключением нескольких проб, которые были взяты раньше.

От 332 пациентов в период с 1-го по 78-й день от начала заболевания были взяты пробы крови на фильтровальную бумагу для исследования ПЦР-методом. От каждого пациента получено как минимум по две пробы (за исключением 14 человек, у которых была взята только одна проба): первую брали при поступлении пациента в стационар, вторую через 7–14 дней после первой, а последующие – с интервалом 7–10 дней.

Всего с целью обнаружения ДНК E. muris методом ПЦР получено 1586 проб цельной крови (табл. 1), из которых 634 были взяты в пробирки Eppendorf, содержащие 0,1 мл антикоагулянта EDTA, а 952 – на фильтровальную бумагу с последующим высушиванием.

ПЦР проводили в лаборатории переносчиков инфекций ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Для получения геномной ДНК использовали коммерческий набор «Проба-НК» (ЗАО «ДНК Технология», Россия, г. Москва). ПЦР проводили в 4-канальном термоциклере «Терцик» этой же фирмы. При необходимости пробы хранили при температуре –20 °С. Для амплификации применены праймеры HE3-MuHE1, фланкирующие участок 16S рРНК гена эрлихий. Амплифицированная ДНК исследована методом горизонтального электрофореза в 1–2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия и трис-боратного буфера при напряжении 165 V; для анализа агарозных гелей использована видеосистема DNA Analyzer с программами Gel-Imager и Gel-analysis версии 1.0.

 

Таблица 1

Число проб крови, полученных от пациентов в разные сроки от начала заболевания и исследованных методом ПЦР

Характеристика проб	Срок от начала заболевания, сут						Всего
	1–7	8–14	15–21	22–28	29–35	36 и более
Первая	427	98	37	8	3	9	582
Вторая	4	343	150	46	12	13	568
Третья		4	110	65	28	127	334
Четвертая			5	52	26	11	94
Пятая				2	2	4	8
Всего / % от общего числа проб	431/27,2	445/28,0	302/19,1	173/10,9	71/4,5	164/10,3	1586/100

 

С целью серологической верификации МЭЧ все пациенты были обследованы с помощью ИФА на базе иммунологической лаборатории ГБУЗ ПК ПККИБ г. Перми в динамике заболевания: при поступлении в стационар и через 10–14 дней. При помощи тест-систем ООО «Омникс» исследовали сыворотки на наличие в них иммуноглобулинов M и G к Е. chaffeensis [15].

Кроме того, всем пациентам была проведена ПЦР и серодиагностика с целью выявления КЭ, ИКБ и ГАЧ. Серодиагностика этих заболеваний осуществлялись с помощью ИФА тест-систем ООО «Омникс» и ЗАО «Вектор-Бест» для выявления иммуноглобулинов M и G к вирусу клещевого энцефалита, B. Burgdorferi sensu lato и A. phagocytophilum. ПЦР-методом исследованы 634 пробы цельной крови и 952 пробы сухих пятен крови с целью обнаружения генетического материала В. burgdorferi sensu lato и A. phagocytophilum. Для амплификации B. burgdorferi sensu lato в nested ПЦР использованы родоспецифичные праймеры (Bb23SN1 – Bb23SC1 и IGSb1 – IGSa2), фланкирующие участок 5S-23S рРНК спейсера. Амплификация специфической ДНК A. phagocytophilum проведена с праймерами ge3a1-ge10r2 и ge9f3-ge2r4, фланкирующими участок 16S рРНК гена.

Результаты и их обсуждение

Из 634 проб, взятых в пробирки Eppendorf, ДНК E. muris обнаружена в 61 (9,6 %) пробе крови от 39 человек, а из 952 проб крови, взятых на фильтровальную бумагу – в 15 (1,6 %) пробах от 14 человек. В общей сложности с помощью метода ПЦР ДНК эрлихий обнаружена в 76 (4,8 %) пробах крови от 53 пациентов. В целом на основании двух методов исследования (ИФА и ПЦР) МЭЧ диагностирован у 58 человек, при этом у 50 (86,2 %) из них диагноз был подтвержден только на основании ПЦР. Так же, как и в странах Запада, ПЦР продемонстрировала способность верифицировать диагноз в случаях неэффективности ИФА, в том числе при серонегативном МЭЧ. При этом, по нашим данным, в отсутствии серологической валидации ПЦР в значительно большей степени была способна подтвердить диагноз эрлихиоза, чем в США (86,2 % в Пермском крае против 11–26 % в США) [16]. Такое превалирование ПЦР над ИФА в Пермском крае, возможно, объясняется не только высокой частотой серонегативного МЭЧ в Предуралье, но и недостаточной чувствительностью выявления антител к E. muris отечественными тест-системами, использующими в наборах композицию рекомбинантных белков другого геновида эрлихий – Ehrlichia chaffeensis [16]. На территории других регионов Российской Федерации также были зафиксированы случаи подтверждения диагноза МЭЧ только на основании метода ПЦР [20]. В связи с этим наши данные подтверждают вывод, сделанный другими исследователями [16, 17], что для получения наиболее достоверного результата верификации МЭЧ целесообразно параллельно использовать оба лабораторных метода: ИФА и ПЦР.

Сроки обнаружения геномного материала E. muris в крови пациентов варьировались от 1 до 58 дней с момента заболевания. Положительный результат дала одна проба, взятая на 105-й день от начала заболевания, что позволяет предположить вероятность длительной персистенции этого возбудителя в организме человека, возможность которой была отмечена ранее для E. сhaffeensis [16]. Как и в отношении этого этиологического агента [16, 17], наибольшая результативность ПЦР (до 69,4 % положительных проб) отмечена нами с 1-го по 7-й дни болезни (табл. 2) [21]. На второй неделе от начала заболевания процент положительных проб снизился почти в 2,5 раза (р < 0,001) по сравнению с первой неделей, что наиболее вероятно связано с нарастанием нейтрализующего действия специфических антител классов М и G, а также началом этиотропной терапии. На третьей и последующих неделях геномный материал E. muris выявлен методом ПЦР почти в половине проб (42,8–53,8 %). Это свидетельствует о возможности его длительного присутствия в крови больных, что имеет особенно важное лабораторно-диагностическое значение при позднем поступлении пациентов в стационар, а также при оценке эффективности ранее проведенной этиотропной терапии.

 

Таблица 2

Частота выявления положительных результатов ПЦР у 53 пациентов c ДНК E. muris в разные сроки от начала заболевания МЭЧ

Срок от начала заболевания, сут	Общее число и процент (P ± 2mp) полученных проб	Из них число и процент (P ± 2mp) положительных проб с ДНК E. muris.
1–7 8–14 15–21 22 и больше	36 (22,1 ± 6,5) 45 (27,6 ± 7,0) 26 (15,9 ± 5,7) 56 (34,4 ± 7,4)	25 (69,4 ± 15,3) 13 (28,9 ± 13,5) 14 (53,8 ± 19,5) 24 (42,8 ± 13,2)
Всего исследовано	163 (100)	76 (46,6)

 

Рис. Структура моноцитарного эрлихиоза человека в виде моно- и микст-инфекции у пациентов Пермского края (по результатам ИФА и ПЦР), %

 

После комплексного обследования 583 пациентов на основании клинико-эпидемиологических, серологических и ПЦР-данных этиология инфекций, передающихся иксодовыми клещами, установлена у 419 (71,9 %).

МЭЧ в виде моно- и микст-инфекций диагностировался у 58 (9,9 %) пациентов (рисунок). Из них в виде моноинфекции – у 9 (15,5 %), в виде микст-инфекции с ИКБ, КЭ и ГАЧ – у 49 (84,5 %). Были выявлены следующие микст-инфекции: МЭЧ+ИКБ – у 35 (60,3 %), МЭЧ+ИКБ+ГАЧ – у 6 (10,3 %), МЭЧ+КЭ+ИКБ+ГАЧ – у 4 (6,9 %), МЭЧ+КЭ – у 2 (3,5 %), МЭЧ+КЭ+ИКБ – у 2 (3,5 %).

Полученные нами данные об уровне зболеваемости МЭЧ в Пермском крае трудно сопоставить с общероссийскими, которые в настоящее время практически отсутствуют. В последние годы только в семи регионах Российской Федерации был диагностирован МЭЧ, причем показатели заболеваемости варьировались от 0,04 на 100 тыс. населения в Воронежской области до 2,8 на 100 тыс. населения в Республике Алтай, хотя ДНК E. muris обнаружена у 0,03–26 % иксодовых клещей в 38 регионах РФ [15].

У 267 пациентов диагностированы моноинфекции КЭ, ИКБ и ГАЧ: КЭ – у 54 (9,3 %), ИКБ – у 187 (32,1 %) и ГАЧ – у 26 (4,4 %). У 94 больных была расшифрована этиология разнообразных микст-инфекции КЭ, ИКБ и ГАЧ: ИКБ+ГАЧ – у 57 (9,8 %) пациентов, ИКБ+КЭ – у 22 (3,8 %), КЭ+ИКБ+ГАЧ – у 9 (1,5 %), КЭ+ГАЧ – у 6 (1,0 %).

У 61 (10,5 %) больного выявлены заболевания, не связанные с присасыванием иксодовых клещей (аденовирусная инфекция, лакунарная ангина, внебольничная пневмония, ветряная оспа, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, лептоспироз, иерсиниоз и т.д.).

Таким образом, у 103 (17,7 %) из 583 больных после проведенного клинико-лабораторного обследования этиология инфекций осталась нерасшифрованной. Данная группа состояла из пациентов с ОЛЗ, у которых единственными проявлениями заболевания была лихорадка и разной степени выраженности общеинфекционный синдром, включавший в себя такие симптомы, как общая слабость, недомогание, озноб, головная боль, головокружение, тошнота и рвота. Не представляется возможным отнести данные случаи заболеваний к инфекциям, передающимся иксодовыми клещами, равно как и исключить их. Они могут быть связаны с другими недостаточно изученными возбудителями, передающимися иксодовыми клещами [7]. Это требует дальнейшего исследования этиологического спектра «клещевых» инфекций, а также совершенствования методов лабораторной диагностики.

Выводы

1. Метод ПЦР продемонстрировал свою эффективность в лабораторном подтверждении диагноза МЭЧ у пациентов из Пермского края, значительно увеличив количество (до 86,2 %) диагностированных случаев. Оптимальные сроки выявления ДНК возбудителя методом ПЦР – первая неделя болезни (69,4 ± 15,3 % положительных проб), что позволяет верифицировать эрлихиоз до появления четких положительных серодиагностических данных или получить лабораторное подтверждение его серонегативного варианта.
2. Для лабораторного подтверждения МЭЧ целесообразно сочетать ИФА с методом ПЦР, особенно при отрицательных результатах серологических исследований.
3. На территории Пермского края МЭЧ выявлен виде моно- и микст-инфекции у 9,9 % пациентов, при этом наиболее часто в виде микст-инфекции с ИКБ (в 60,3 % случаев).

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

В. Ю. Тетерин

Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера

Автор, ответственный за переписку.
Email: infect-perm@mail.ru

кандидат медицинских наук, ассистент кафедры инфекционных болезней

Россия, Пермь

Э. И. Коренберг

Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: infect-perm@mail.ru

заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор биологических наук, профессор, руководитель отдела природно-очаговых инфекций

Россия, Москва

В. В. Нефедова

Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: infect-perm@mail.ru

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории переносчиков инфекций

Россия, Москва

Н. Н. Воробьева

Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера

Email: infect-perm@mail.ru

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней

Россия, Пермь

О. Н. Сумливая

Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера

Email: infect-perm@mail.ru

доктор медицинских наук, профессор кафедры инфекционных болезней

Россия, Пермь

М. А. Окишев

Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера

Email: infect-perm@mail.ru

кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней

Россия, Пермь

В. В. Семериков

Пермская краевая клиническая инфекционная больница

Email: infect-perm@mail.ru

доктор медицинских наук, заведующий эпидемиологическим отделом

Россия, Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы