Induction of immune response caused by G-01 solution in laboratory animals with transplanted melanoma (B-16)

Full Text

Введение

Плазматическая мембрана участвует в межклеточных контактах, воспринимает, усиливает и передает внутрь клетки сигналы внешней среды. С плазматической мембраной связаны многие ферменты, катализирующие биохимические реакции [1]. Среди множества ферментов практически каждого метаболического пути различают ключевые, или регуляторные, ферменты, активность которых может изменяться в зависимости от потребности клетки в конечном продукте метаболического пути. Регуляторные ферменты расположены, как правило, в начале или в месте разветвления метаболического пути. Углеводные компоненты, находящиеся на поверхности клеток, служат своеобразной маркировкой при выработке иммунного ответа [2]. Нарушения, связанные с метаболизмом углеводов, могут быть показательными для иммунной системы организма.

Основой вышеперечисленных мероприятий является феномен иммунологической памяти. Несмотря на то, что как клинический феномен он известен с древних времен, клеточные и молекулярно-генетические механизмы иммунологической памяти до настоящего времени до конца не изучены. Целый ряд параметров: химическая природа антигена, доза антигена, входные ворота, влияние антигена на другие системы организма оставляют место для научного подхода [3].

Поскольку иммунотерапевтические подходы к профилактике онкологических заболеваний разнообразны и специфичны, нашей задачей явилась разработка метода универсального иммунного ответа, обладающего влиянием на клетки опухоли через запрограммированную клеточную гибель – апоптоз.

Цель исследования – изучить свойства иммунного ответа раствором G-01 на примере меланомы (В-16).

Материалы и методы исследований

Опыты проведены на разнополых мышах BALB, полученных из питомника п. Чишмы Штамм опухоли меланомы В-16, приобретен в лаборатории комбинированной терапии опухолей, Банке опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Опыты проведены на потомстве разнополых BALB/с возрастом 8 недель. Группы потомства по полу не разделялись. Спонтанных регрессий в группах контроля не наблюдалось. Животных содержали в стандартных условиях на естественном питании в соответствии с действующими нормами содержания экспериментальных животных. Все манипуляции на животных проводили согласно международным этическим и научным стандартам планирования и выполнения исследований на животных [4]. Стерилизация соединения проводилась под давлением через мембранные фильтры диаметром до 20 Нм. В качестве средства воздействия на родительские особи использовался моносахарид гексоза. Рабочий шифр: G-01.

В работе использовали 20 % раствор G-01, вводимый по 0,5 мл подкожно 2 раза в день в течение двух суток с наличием адъюванта (гидроксида алюминия). В первом эксперименте раствор использовался как профилактическое средство, во втором – как лечебное, применяемое на 6-е сутки после перевивки меланомы (В-16).

Статистическая обработка: полученные в ходе исследования медико-биологические данные обрабатывались с применением программы Statistica 7 (Stat Soft) версии 6.0. Сопоставление частотных характеристик качественных показателей проводилось с помощью непараметрических метода – точного критерия Фишера (для малых групп). При множественных сравнениях – с соответствующими поправками. Доверительные интервалы для частотных показателей рассчитывались с использованием точного критерия Фишера. Для изучения взаимосвязи иммунотерапии и частоты летальных исходов в группах сравнения был рассчитан коэффициент корреляции для номинальных переменных, основанный на статистике «Хи-квадрат», применимый к таблицам сопряженности (2´2), и коэффициент сопряженности признаков Пирсона (С), характеризующий связь номинальных переменных для многопольных таблиц сопряжения [1; 3].

Результаты и их обсуждение

Для проведения эксперимента превентивный курс терапии проведен мышам Balb/c разного пола и разной весовой категории. Спустя месяц после проведенной оптимальной схемы терапии была произведена попытка перевивки меланомы подкожно 10 мышам основной группы. Группу контроля составили 6 мышей. Через три недели обнаружен рост образования в правой подмышечной области у 2 мышей в основной группе. Образование в течение последующих трех недель регрессировало. В группе контроля меланома перевилась 5 мышам из 6, с последующим развитием заболевания и летальным исходом в среднем на 60-е сутки заболевания.

Следующие попытки перевивки меланомы В-16 проводились раз в месяц (рис. 1), периодически проявлялся рост образований с последующей регрессией в основной группе и 100 % случаев перевивки с последующим летальным исходом в группе контроля.

 

Рис. 1. Частота летальных исходов в основной и контрольной группах

 

Через 7 месяцев в основной группе выявлен рост В-16 у одной беременной мыши из 10, после родов мышь умерла. Через 8 месяцев в основной группе выявлен рост В-16 у 4 из 10 мышей. Из них 2 беременные самки и 2 самца. У самцов образование регрессировало. Самки погибли через месяц.

 

Частота летальных исходов в основной и контрольной группах экспериментальных животных за период наблюдения, %

Исследуемая группа	Летальный исход есть	Летального исхода нет	Всего
Основная группа, абс. (%)	3 (3,75)	77 (96,25)	80 (100)
Группа контроля, абс. (%)	46 (95,8)	2 (4,2)	48 (100)

 

Учитывая, что летальные случаи встречались в основной группе только через 7 месяцев после начала иммунокорригирующей терапии, частота неблагоприятных исходов в сравниваемых группах была проанализирована в целом за 8 месяцев наблюдения (таблица).

Частота летальных исходов в группах животных за период наблюдения была достоверно выше в группе контроля по сравнению с таковой в группе (c² = 103,8; р < 0,0005).

Отношение шансов (OR) неблагоприятного исхода в основной группе к шансам группы контроля составило 0,0021 (0,21 %), 95 % ДИ [0, 0006; 0, 0131], это свидетельствует, что неблагоприятный исход выше в группе контроля.

Анализ коэффициента корреляции φ для номинальных переменных, основанного на статистике «Хи-квадрат» и соответственно применимый к таблицам сопряженности (2´2), показал, что 

$\phi =\sqrt{\frac{{\chi }^2}{n}}=\sqrt{\frac{103,8}{128}}=0,9 (p <0,001),$

где n – общая сумма частот по ячейкам (число животных, взятых в анализ за период наблюдения). Связь считается установленной, если значение коэффициента находится в пределах от 0,5 до 1,0.

Рассчитанный показатель характеризует сильную взаимосвязь между проведением иммунокоррекции и частотой неблагоприятных исходов.

Для наглядности нами было произведено исследование подкожно-жировой клетчатки (рис. 2) правой подмышечной области 5 мышей Balb/c основной группы через 6 месяцев после перевивки и спустя 7 месяцев после индукции иммунного ответа раствором G-01.

 

Рис. 2. Остаточная пигментация в области подкожной инъекции меланомы (В-16) через 6 месяцев после перевивки в основной группе

 

По данным литературы продолжительность иммунитета у мыши длительностью в 6 месяцев приблизительно равняется 5–6 годам жизни человека [5]. Мы можем предположить, что проводимая нами индукция иммунного ответа у человека может продолжаться до 5–6 лет, что соответствует иммунитету после вакцинации от таких инфекций, как столбняк, гепатит и т.д.

Курс терапии раствором G-01 мышей с перевитой меланомой. Терапия мышам Balb/c начата на 6-е сутки после подкожной перевивки меланомы. Анализировались две группы – контрольная и основная. Опухоль перевилась в 100 % случаев.

Погибли мыши в обеих группах. Средняя продолжительность жизни в обеих группах составила 36 и 38 суток соответственно. Статистически значимых различий в группах не выявлено. За все время эксперимента после введения раствора G-01 нами не наблюдались какие-либо осложнения, возникающие при применении вакцин, разработка которых основана на свойствах адаптивного иммунитета.

Выводы

1. Неспецифическая стимуляция иммунной противоопухолевой реакции является обязательным условием противоопухолевого иммунитета, индуцируемого раствором G-01.
2. Иммунная память на примере перевитой меланомы действует в течение минимум 6 месяцев. В последующие месяцы наблюдается постепенное снижение толерантности к перевиваемой опухоли.
3. Вводимый подкожно 20 % раствор
   G-01 по 0,5 мл о 2 раза в день в течение двух суток на 6-е сутки после перевивки на меланому не действует.

Таким образом, данный метод индукции иммунного ответа раствором G-01 может быть использован для профилактики развития солидной опухоли меланомы В-16 у животных.

 

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов равноценен.

About the authors

R. M. Garaishin

Bashkir State Medical University

Author for correspondence.
Email: garaishin@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-6690-4086

Russian Federation, Ufa

Sh. R. Kzyrgalin

Bashkir State Medical University

Email: garaishin@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-9721-108X

Candidate of Medical Sciences, Assistant, Department of Oncology with Courses of Oncology and Pathological Anatomy

Russian Federation, Ufa

R. R. Kitapova

Bashkir State Medical University

Email: garaishin@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-9911-5665

Candidate of Pharmacological Sciences, Associate Professor, Department of Pharmacology with Course of Clinical Pharmacology

Russian Federation, Ufa

D. A. Kostromina

Republican Clinical Oncological Dispensary

Email: garaishin@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-3076-850X

Oncologist

Russian Federation, Ufa

D. R. Garaishina

Bashkir State Medical University

Email: garaishin@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9971-071X

fourth-year student, Pediatric Faculty

Russian Federation, Ufa

T. R. Zaleev

Bashkir State Medical University

Email: garaishin@list.ru

fourth-year student, Medical Faculty

Russian Federation, Ufa

References

Supplementary files