Changes in growth characteristics and biofilm-forming activity of Escherichia coli with cholesterol available

Cover Page

Abstract


Aim.To assess the growth properties and formation of E. сoli biofilms with different concentrations of cholesterol available.

Materials and methods. E. coli strains were cultivated in the meat-peptone broth with cholesterol added in the concentration of 3, 5, 7 and 9 mmol/l as well as in the nutrient medium without cholesterol. The growth parameters and cholesterol concentration in the samples prior to and after cultivating microorganisms and the effect of cholesterol on biofilm-forming activity of E. coli was determined.

Results. Cholesterol was shown to have no bactericidal effect on E. coli, however, it is able to change the duration of growth phases of the strains that is, possibly, caused by adaptation to the presence of cholesterol and switching of metabolic pathways. Cholesterol has a stimulating effect on accumulation of biomass by the test-strain and its biofilm-forming activity.

Conclusions. In the study performed, the ability of E. coli to metabolize human cholesterol was shown.


ВВЕДЕНИЕ

В последнее время активно изучается вопрос о взаимодействии микроорганизмов с эукариотическими клетками [1]. Контакты между организмами осуществляются на молекулярном уровне, когда молекулы макроорганизма в той или иной степени могут быть участниками метаболизма прокариотических клеток. Показано, что резидентная и транзиторная микрофлора кишечника человека, синтезируя, трансформируя или разрушая экзогенные и эндогенные стерины, активно участвует в метаболизме макромолекул, в частности холестерина [2–3]. Описана утилизация холестерина микроорганизмами как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Первая идентификация продуктов деградации холестерина была представлена Horvath и Krimli в 1947 г., которые продемонстрировали продукцию холестенона и 7-дегидрохолестерина у видов Azotobacter [6].

Относительно мало сведений о включении холестерина в метаболизм микроорганизмов, имеющих медицинское значение. Идеальной системой для изучения биосинтеза фосфолипидов является Escherichia coli, поскольку ферменты микроорганизма участвуют в биосинтезе de novoфосфолипидов [6]. В связи с этим можно предположить, что ферменты E. сoli могут быть вовлечены в метаболизм холестерина.

Цель исследования – оценить ростовые свойства и образование биопленок E. сoli в присутствии разных концентраций холестерина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании использованы штаммы E. сoli из коллекции АТСС, которые культивировали в мясопептонном бульоне с добавлением холестерина (США) в концентрациях 3; 5; 7 и 9 ммоль/л, а также в питательной среде, не содержащей холестерин. В течение 24 ч каждый час проводили измерение оптической плотности бульона при 580 нм с помощью планшетного спектрофотометра PowerWave X (США). Концентрацию холестерина определяли в пробах до и после культивирования микроорганизмов.

Для определения антибактериального действия холестерина использовали диско-диффузионный метод, когда диски из стерильной фильтрованной бумаги пропитывали в растворах с разной концентрацией холестерина. После непродолжительного подсушивания диски помещали на поверхность мясопептонного агара с посевом тест-штамма. Учитывали зоны задержки роста вокруг дисков в миллиметрах.

Биопленкообразующую активность E. coli в присутствии разных концентраций холестерина определяли согласно [5] в плоскодонных полистироловых планшетах. В лунки планшета вносили микробную суспензию тест-штамма и готовили разведения холестерина. Для каждой концентрации холестерина использовали не менее 3 повторностей. Через 24 ч инкубации планктонную часть удаляли, лунки промывали физиологическим раствором и окрашивали генцианвиолетом с последующей спиртовой экстракцией окрашенного продукта [5].

Для определения уровня холестерина в питательной среде использовали ферментативный метод с помощью набора реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Детекцию результатов осуществляли с помощью планшетного спектрофотометра PowerWave X (США). Суть метода заключается в том, что под действием фермента фолестеролэстеразы эфиры холестерина распадаются на холестерин и жирные кислоты. Далее холестерин окисляется под воздействием холестеролоксидазы с выделением перекиси водорода. Образовавшаяся перекись водорода в ходе реакции Триндера формирует окрашенное соединение. Интенсивность окраски реакционной среды прямо пропорциональна исходному содержанию холестерина в анализируемом растворе и определялась фотометрическим методом на приборе PowerWave X (США) в кюветах с длиной оптического слоя 10 мм при зеленом светофильтре (максимум поглощения – 540 нм). Результат выражали в условных единицах оптической плотности (у.е.).

Статистическую обработку данных проводили с использованием парного варианта t-критерия Стьюдента, а также коэффициента корреляции Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью диско-диффузионного метода показан рост тест-штаммов вплотную к дискам, пропитанным холестерином, во всех изученных концентрациях. Следовательно, холестерин не обладает антибактериальным действием на E. сoli.

В присутствии холестерина удлиняется фаза экспоненциального роста штаммов, что задерживает начало стационарной фазы. При культивировании E. сoli в мясо-пептонном бульоне без холестерина фаза стационарного роста начинается через 6 ч, а в присутствии разных концентраций холестерина – через 18 ч (рисунок). Подобная ситуация может быть обусловлена переключением ряда метаболических путей, когда

 

Рис. Кинетика роста E. сoli в присутствии разных концентраций холестерина

 

происходит увеличение экспрессии генов, кодирующих синтез ферментов, метаболизирующих холестерин.

При изучении биопленкообразующей активности установлено ее увеличение при культивировании E. сoli с холестерином в концентрации 3 ммоль/л – 0,55 ± 0,03 у.е. (в контрольных пробах – 0,30 ± 0,03 у.е.; p < 0,05). При увеличении концентрации холестерина способность E. сoli к образованию биопленки существенно не меняется.

При проведении корреляционного анализа показано наличие прямой связи между концентрацией холестерина и уровнем биомассы (r = 0,69) и обратной связи между концентрацией холестерина и выраженностью биопленкообразующей активности E. сoli (r = –0,71). Можно предположить, что при высокой концентрации холестерина микроорганизм переключает свой метаболизм, когда снижается синтез полисахаридов, необходимых для образования матрикса биопленки. В то же время в такой ситуации наблюдается избыточное накопление биомассы E. сoli. Более того, показано, что утилизация липидов и холестерина микроорганизмами лежит в основе нарушения функционирования гистогематических барьеров [4].

ВЫВОДЫ

Таким образом, в проведенном исследовании показана способность E. сoli метаболизировать человеческий холестерин, который, возможно, используется при формировании новых клеток микроорганизма.

Результаты исследования могут быть использованы для поиска и разработки способов коррекции содержания холестерина в крови с целью повышения эффективности лечения дислипидемических нарушений.

L. P. Bykova

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: AGodovalov@gmail.com

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

доцент кафедры микробиологии и вирусологии

Ya. P. Trapeznikov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: AGodovalov@gmail.com

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

студент лечебного факультета

A. P. Godovalov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: AGodovalov@gmail.com

Russian Federation, 26, Petropavlovskay street, Perm, 614000

в.н.с

  1. Годовалов А.П., Быкова Л.П., Бадыков И.И. Холестеринметаболизирующая активность клинических штаммов Candida albicans. Боткинские чтения: материалы Всерос. науч.-практ. конф. СПб. 2017; 52–53.
  2. Трапезников Я.П., Быкова Л.П., Годовалов А.П. Холестеринметаболизирующая активность Staphylococcus aureus. Материалы I Российского микробиологического конгресса. Пущино 2017; 129.
  3. Хамагаева И.С., Цыбикова А.Х., Замбалова Н.А. Исследование холестеринметаболизирующих свойств пробиотических микроорганизмов. Молочная промышленность 2011; 10: 56.
  4. Loh L.N., McCarthy E.M.C., Narang P., Khan N.A., Ward T.H. Escherichia coli K1 utilizes host macropinocytic pathways for invasion of brain microvascular endothelial cells. Traffic 2017; 18(11): 733–746.
  5. O'Toole G.A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp 2011; 47: 2437.
  6. Wilkison W.O., Bellr R.M. sn-Glycerol-3-phosphate acyltransferase from Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta 1997; 1348: 3–9.

Supplementary files

Supplementary Files Action
1. Fig. Growth kinetics of E. coli in the presence of different cholesterol concentrations View (29KB) Indexing metadata

Views

Abstract - 69

PDF (Russian) - 108

Cited-By


PlumX


Copyright (c) 2019 Bykova L.P., Trapeznikov Y.P., Godovalov A.P.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies