Изменение ростовых характеристик и биопленкообразующей активности Escherichia coli в присутствии холестеринаó

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время активно изучается вопрос о взаимодействии микроорганизмов с эукариотическими клетками [1]. Контакты между организмами осуществляются на молекулярном уровне, когда молекулы макроорганизма в той или иной степени могут быть участниками метаболизма прокариотических клеток. Показано, что резидентная и транзиторная микрофлора кишечника человека, синтезируя, трансформируя или разрушая экзогенные и эндогенные стерины, активно участвует в метаболизме макромолекул, в частности холестерина [2–3]. Описана утилизация холестерина микроорганизмами как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Первая идентификация продуктов деградации холестерина была представлена Horvath и Krimli в 1947 г., которые продемонстрировали продукцию холестенона и 7-дегидрохолестерина у видов Azotobacter [6].

Относительно мало сведений о включении холестерина в метаболизм микроорганизмов, имеющих медицинское значение. Идеальной системой для изучения биосинтеза фосфолипидов является Escherichia coli, поскольку ферменты микроорганизма участвуют в биосинтезе de novoфосфолипидов [6]. В связи с этим можно предположить, что ферменты E. сoli могут быть вовлечены в метаболизм холестерина.

Цель исследования – оценить ростовые свойства и образование биопленок E. сoli в присутствии разных концентраций холестерина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании использованы штаммы E. сoli из коллекции АТСС, которые культивировали в мясопептонном бульоне с добавлением холестерина (США) в концентрациях 3; 5; 7 и 9 ммоль/л, а также в питательной среде, не содержащей холестерин. В течение 24 ч каждый час проводили измерение оптической плотности бульона при 580 нм с помощью планшетного спектрофотометра PowerWave X (США). Концентрацию холестерина определяли в пробах до и после культивирования микроорганизмов.

Для определения антибактериального действия холестерина использовали диско-диффузионный метод, когда диски из стерильной фильтрованной бумаги пропитывали в растворах с разной концентрацией холестерина. После непродолжительного подсушивания диски помещали на поверхность мясопептонного агара с посевом тест-штамма. Учитывали зоны задержки роста вокруг дисков в миллиметрах.

Биопленкообразующую активность E. coli в присутствии разных концентраций холестерина определяли согласно [5] в плоскодонных полистироловых планшетах. В лунки планшета вносили микробную суспензию тест-штамма и готовили разведения холестерина. Для каждой концентрации холестерина использовали не менее 3 повторностей. Через 24 ч инкубации планктонную часть удаляли, лунки промывали физиологическим раствором и окрашивали генцианвиолетом с последующей спиртовой экстракцией окрашенного продукта [5].

Для определения уровня холестерина в питательной среде использовали ферментативный метод с помощью набора реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Детекцию результатов осуществляли с помощью планшетного спектрофотометра PowerWave X (США). Суть метода заключается в том, что под действием фермента фолестеролэстеразы эфиры холестерина распадаются на холестерин и жирные кислоты. Далее холестерин окисляется под воздействием холестеролоксидазы с выделением перекиси водорода. Образовавшаяся перекись водорода в ходе реакции Триндера формирует окрашенное соединение. Интенсивность окраски реакционной среды прямо пропорциональна исходному содержанию холестерина в анализируемом растворе и определялась фотометрическим методом на приборе PowerWave X (США) в кюветах с длиной оптического слоя 10 мм при зеленом светофильтре (максимум поглощения – 540 нм). Результат выражали в условных единицах оптической плотности (у.е.).

Статистическую обработку данных проводили с использованием парного варианта t-критерия Стьюдента, а также коэффициента корреляции Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью диско-диффузионного метода показан рост тест-штаммов вплотную к дискам, пропитанным холестерином, во всех изученных концентрациях. Следовательно, холестерин не обладает антибактериальным действием на E. сoli.

В присутствии холестерина удлиняется фаза экспоненциального роста штаммов, что задерживает начало стационарной фазы. При культивировании E. сoli в мясо-пептонном бульоне без холестерина фаза стационарного роста начинается через 6 ч, а в присутствии разных концентраций холестерина – через 18 ч (рисунок). Подобная ситуация может быть обусловлена переключением ряда метаболических путей, когда

 

Рис. Кинетика роста E. сoli в присутствии разных концентраций холестерина

 

происходит увеличение экспрессии генов, кодирующих синтез ферментов, метаболизирующих холестерин.

При изучении биопленкообразующей активности установлено ее увеличение при культивировании E. сoli с холестерином в концентрации 3 ммоль/л – 0,55 ± 0,03 у.е. (в контрольных пробах – 0,30 ± 0,03 у.е.; p < 0,05). При увеличении концентрации холестерина способность E. сoli к образованию биопленки существенно не меняется.

При проведении корреляционного анализа показано наличие прямой связи между концентрацией холестерина и уровнем биомассы (r = 0,69) и обратной связи между концентрацией холестерина и выраженностью биопленкообразующей активности E. сoli (r = –0,71). Можно предположить, что при высокой концентрации холестерина микроорганизм переключает свой метаболизм, когда снижается синтез полисахаридов, необходимых для образования матрикса биопленки. В то же время в такой ситуации наблюдается избыточное накопление биомассы E. сoli. Более того, показано, что утилизация липидов и холестерина микроорганизмами лежит в основе нарушения функционирования гистогематических барьеров [4].

ВЫВОДЫ

Таким образом, в проведенном исследовании показана способность E. сoli метаболизировать человеческий холестерин, который, возможно, используется при формировании новых клеток микроорганизма.

Результаты исследования могут быть использованы для поиска и разработки способов коррекции содержания холестерина в крови с целью повышения эффективности лечения дислипидемических нарушений.

Об авторах

Лилия Павловна Быкова

Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера

Автор, ответственный за переписку.
Email: AGodovalov@gmail.com

доцент кафедры микробиологии и вирусологии

Россия, 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская 26

Яков Павлович Трапезников

Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера

Email: AGodovalov@gmail.com

студент лечебного факультета

Россия, 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская 26

Анатолий Петрович Годовалов

Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера

Email: AGodovalov@gmail.com

в.н.с

Россия, 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская 26

Список литературы

Дополнительные файлы