ASSESSMENT OF HEMATOLOGICAL AND MORPHOLOGICAL INDICES IN EXPERIMENTAL ANIMALS WHILE IMPLANTATING CARBON COMPOSITION FIBER

Full Text

Введение Проблема разработки биосовместимых материалов медицинского назначения сохраняет свою актуальность на протяжении нескольких десятилетий. К материалам стоматологического назначения предъявляется ряд требований, в частности: отсутствие токсичности, коррозионная устойчивость, прочность, технологичность, близость показателей физических свойств материалов к таковым у естественных тканей. Уровень электрохимического потенциала углеродных материалов приближен к таковому у биологических сред живых организмов, поскольку углерод является одним из химических элементов, входящих в их состав. Он отличается биологической и химической инертностью, отсутствием токсичности и канцерогенности [1]. Развитие технологии получения различных видов углеродных материалов, наряду с выявленной совместимостью с живыми тканями и биологическими средами, привело к активизации исследований, а также разработке новых композиционных материалов на основе углерода и его соединений. Цель исследования - изучить реакцию лейкоцитов периферической крови и органов иммунной системы на имплантацию углеродного композиционного волокна экспериментальным животным. Материалы и методы исследования Исследования проведены на 70 крысах-самцах линии Wistar. Через 7, 15 и 30 суток после имплантации углеродного волокна (УВ) у животных получали образцы крови из хвостовой вены. Для определения состава клеток периферической крови фиксированные мазки окрашивали азур-эозином по методу Романовского-Гимзы и подсчитывали число эозинофилов, базофилов, нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. Фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови изучали с использованием формалинизированных эритроцитов барана по методу В. Н. Каплина [2-4]. С целью определения реакции биологических тканей на внутримышечное введение образцов УВ осуществляли морфологическое исследование органов опытных животных. Эксперимент проводился в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей; в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных»; с требованиями международного стандарта ISO 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий»; рекомендациями «Сборник руководящих методических материалов по токсико-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий медицинского назначения» и утвержден решением этического комитета ГБОУ ВПО ПГМУ им. академика Е. А. Вагнера Минздрава России. В эксперименте использованы 2 группы беспородных белых крыс (самцов), содержащихся на стандартной диете вивария: первую группу составляли 25 животных, которым внутримышечно имплантировано «чистое» УВ, а вторую - 25 животных с внутримышечно введенным аппретированным УВ. Контрольная группа включала в себя 20 животных, содержащихся на тех же условиях, что и животные экспериментальных групп, но без имплантации каких-либо материалов. Выведение животных из эксперимента проводили на 15-е (ранний срок) и 30-е (отдаленный срок) сутки после операции, что соответствует международному стандарту ИСО/ДИС «Биологический контроль материалов и изделий медицинского назначения», в котором определена длительность имплантационного теста от 7 до 90 суток (Draft International Standard). Для гистологического исследования забирали образцы селезенки, брыжеечных лимфатических узлов, скелетной мышечной ткани из зоны имплантации материала. Органы фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине (pH = 7,0), гистологические препараты изготавливали в соответствии со стандартными методиками с заливкой в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Съемку препаратов проводили на морфометрической установке «Олимпус» (заведующая лабораторией отдела учебно-методического и научного обеспечения ГБОУ ВПО ПГМУ им. академика Е. А. Вагнера кандидат биологических наук Н. В. Чемурзиева). Статистическую обработку данных проводили с использованием непарного варианта t-критерия Стьюдента. За пороговый уровень значимости принимали величину p < 0,05. Результаты и их обсуждение Во все сроки наблюдения статистически значимого увеличения количества лейкоцитов периферической крови не отмечено. Непосредственно перед имплантацией в крови экспериментальных животных количество лейкоцитов составило 9300,0 ± 281,7 в 1 мкл, через 7 суток от момента имплантации - 9360,0 ± 254,4 в 1 мкл (p > 0,05), через 15 суток - 9266,7 ± 240,4 в 1 мкл (p > 0,05) и через 30 суток - 10100,0 ± 341,6 в 1 мкл (p > 0,05). При оценке состава клеток периферической крови не выявлено статистически значимых изменений количества эозинофилов, базофилов и палочкоядерных нейтрофилов во все сроки наблюдения. До имплантации число сегментоядерных нейтрофилов составило 2961,0 ± 297,9 в 1 мкл, через 7 суток после имплантации оно статистически значимо снизилось до 2152,0 ± 95,9 в 1 мкл (p < 0,05). Через 15 и 30 суток после имплантации количество сегментоядерных нейтрофилов статистически значимо не отличалось от числа таковых до имплантации. Подобные изменения количества сегментоядерных нейтрофилов, вероятно, связаны с активацией клеток в первые сутки после внедрения имплантата. Число моноцитов в периферической крови экспериментальных животных до имплантации составило 20,4 ± 7,3 в 1 мкл. Через 7 суток после имплантации количество моноцитов статистически значимо увеличилось и составило 77,6 ± 20,3 в 1 мкл (p < 0,05). Через 15 суток после имплантации количество моноцитов было 108,7 ± 16,8 в 1 мкл (p < 0,05), а через 30 суток - 104,0 ± 42,5 в 1 мкл (p < 0,05). Увеличение числа моноцитов в периферической крови совпадает с увеличением потребности в этих клетках на периферии, в очаге внедрения имплантата, поскольку основная функция тканевых макрофагов заключается в утилизации разнообразных объектов. Известно, что существует несколько вариантов активации макрофагов [5]. Одна из них, альтернативная, способствует репаративным процессам и ремоделированию ткани, когда у макрофагов повышается способность к дифференцировке в прогениторные клетки фибробластического дифферона, увеличивать синтез компонентов межклеточного матрикса [6]. При оценке фагоцитарной активности лейкоцитов показано, что через 7 суток после имплантации число фагоцитирующих клеток было статистически значимо меньше (22,8 ± ± 0,6 %), чем до имплантации - 31,9 ± 2,3 % (p < 0,05). Через 15 и 30 суток после имплантации число фагоцитов статистически значимо не отличалось от такового до имплантации. Аналогичная тенденция обнаружена при оценке фагоцитарного числа. Подобное снижение фагоцитарной активности, в том числе среди моноцитов, вероятно, указывает на преобладание стимулов альтернативной активации макрофагов. Через 7 суток после имплантации число лимфоцитов в периферической крови составило 6977,2 ± 133,8 в 1 мкл и было статистически значимо выше, чем до имплантации (5945,6 ± 441,5 в 1 мкл; p < 0,05). Через 15 и 30 суток число лимфоцитов статистически значимо не отличалось от такового до момента имплантации (6463,0 ± 108,0 в 1 мкл и 7079,0 ± 97,0 в 1 мкл соответственно; p > 0,05). При изучении гистологического строения скелетной мышечной ткани в месте контакта с углеродным волокном на 15-е сутки верифицировали умеренный отек и рыхлость расположения мышечных волокон. Исчерченность волокон хорошо просматривается (рис. 1, а). На всем своем протяжении волокна сохраняют ровный ход. На поперечном срезе симпласта - ядра округлой формы, прилежат к сарколемме. Расстояние между миофибриллами несколько увеличено, лежат рыхло. В прослойках соединительной ткани (эндомизий) наблюдается слабое расширение и наполнение клетками крови сосудов мелкого калибра. Периваскулярных признаков воспаления не установлено. В некоторых участках наблюдали единичное присутствие клеток лейкоцитарного ряда, без признаков их активации. Соединительная ткань в прослойках между волокнами богата клетками, в составе которых доминируют клетки фибробластического дифферона. Фибробласты располагаются преимущественно вблизи капилляров эндомизия, часть клеток митотически активна. скелетная в ранний срок а скелетная мышечная ткань б Рис. 1. Скелетная мышечная ткань в месте контакта с углеродным волокном без аппрета: а - в ранний; б - в отдаленный срок наблюдения. Окраска гематоксилин- эозином, ув. на 600 Через 30 дней исследования морфологической реакции на имплантацию углеродного волокна со стороны скелетной мышечной ткани не было. Мышечные волокна формировали ровные пучки, но при введении волокна с аппретом наблюдали умеренное их утолщение и некоторую рыхлость расположения, при этом миофибриллы в этих участках располагались упорядоченно. В волокнах хорошо верифицировалась исчерченность. Сосуды в окружающей их соединительной ткани спокойные, большей частью пустые. Периваскулярных лейкоцитарных инфильтратов и признаков воспаления в эндомизии нет. В месте контакта с имплантатами имеются участки разрастания соединительной ткани (рис. 1, б). В селезенке у животных при имплантации имеются признаки иммунного напряжения разной степени выраженности. При введении углеродного волокна с аппретом в паренхиме органа наблюдаются расширение и переполнение венозных сосудов клетками крови, признаки умеренного гемостаза. Селезеночные тяжи широкие и переполнены клетками крови. В тяжах красной пульпы участки скопления гемосидерина. Белая пульпа сформирована, лимфоидные узелки крупные, разные по активности, в некоторых случаях окружены широкой маргинальной зоной. На 30-е сутки эксперимента в селезенке, независимо от типа имплантируемого волокна, белая пульпа занимает около трети органа и представлена вторичными лимфоидными узелками разного размера. В пределах органа их активность разная. Многие из них содержат пролиферирующие клетки лимфоидного ряда. Все функциональные зоны белой пульпы развиты. В красной пульпе синусы умеренно расширены, частично заполнены клетками крови. В селезеночных тяжах скопление форменных элементов крови, преимущественно эритроцитов. Присутствуют также макрофаги, зернистые и незернистые лейкоциты и плазмоциты на разных стадиях созревания. Крупные сосуды полупустые, эндотелий формирует ровную выстилку. Трабекулярные вены широкие, заполнены клетками крови, преимущественно эритроцитами. В лимфатических узлах, независимо от типа введения имплантата, наблюдали признаки умеренного иммунного напряжения, проявляющиеся увеличением функциональных зон (рис. 2). В корковом веществе скопление лимфоидных узелков разного размера и активности. Участки междуузелковой зоны заполнены лимфоцитами. Синусы в этой части расширены, некоторые переполнены клетками. Паракортикальная зона широкая, клетки в ней формируют плотное скопление. Расположенные в этой части посткапиллярные венулы расширены, выстланы высоким эндотелием. Часть сосудов переполнена клетками крови. В мозговом веществе тяжи широкие, переполнены клетками крови. Окружающие синусы расширены, содержат лимфоциты. В этой части органа у животных при введении имплантата с аппретом наблюдается сосудистая реакция со стороны гемокапилляров. Мелкие кровеносные сосуды увеличены в объеме, наблюдаются умеренные признаки замедления капиллярного кровотока, явления гемостаза. лимфатический узел с аппретом Рис. 2. Лимфатический узел при введении углеродного волокна с аппретом. Стрелками показано полнокровие сосудов. Окраска гематоксилин-эозином, ув. на 400 В лимфатических узлах у животных обеих групп на 30-е сутки в области коры формировались вторичные узелки среднего размера, большая часть которых в состоянии активности. В центральной части большинства из них присутствуют лимфобласты и макрофаги. Междуузелковые пространства в большинстве случаях свободные, в этих участках просматриваются расширенные синусы. Паракортикальная зона развита умеренно. Клетки лежат плотно. В мозговом веществе тяжи имеют четкое очертание и состоят из клеток лимфоидного ряда. Синусы во всех зонах органа спокойные, клетками не перегружены. Выводы В ходе проведенных исследований установлено, что в первые 7 суток после имплантации наблюдается активация клеток иммунной системы, преимущественно моноцитарно-макрофагальной системы и лимфоцитов. Подобные изменения отражают первый этап развития иммунного ответа, когда моноцитарно-макрофагальные клетки осуществляют распознавание внедренного объекта и представляют полученную информацию лимфоцитам. В более поздние сроки активность лимфоцитарного звена снижается, а у моноцитарно-макрофагальных клеток наблюдается альтернативная активация, способствующая регенеративным процессам. В целом показано отсутствие значимой реакции со стороны лимфоидных органов, а также отсутствие изменений мышечной ткани. Результаты эксперимента показали, что при имплантации углеродного волокна выраженных патоморфологических изменений в органах экспериментальных животных не выявлено. Установлены однотипные морфологические процессы со стороны биологических тканей: на ранних сроках отмечена умеренная реакция сосудов, которая проявляется замедлением капиллярного и венозного кровообращения, что сопровождается слабым отеком, без серьезных структурных перестроек. К концу исследования состояние органов соответствует нормальному физиологическому строению. При использовании углеродных материалов наблюдается активация моноцитарно-макрофагального и лимфоцитарного звеньев иммунной системы в первые 7 суток, что, вероятно, будет способствовать формированию репаративного процесса в последующие 30 суток. Данные эксперимента подтвердили биологическую совместимость углеродного волокна по отношению к тканям организма, что дает возможность использования данного материала в практической стоматологии.

About the authors

O N Sedegova

Email: olgasedegova@gmail.com

N B Astashina

N P Loginova

A P Godovalov

References

Supplementary files