ROLE OF CALCIUM-PHOSPHATE BIONS IN PATHOGENESIS OF ATHEROSCLEROSIS: TOXICITY FOR ENDOTHELIUM

Full Text

Введение В 2013 г. научной группе из Тайваня удалось успешно синтезировать семейство минералоорганических наночастиц из различных солей и фосфатов [9]. Было предположено, что данные неживые биомиметические частицы, называющиеся «бионами», являются частью физиологического механизма, регулирующего функцию, транспорт и выведение элементов и минералов в организме человека [9]. Кальцийфосфатные бионы (КФБ) формируются при избытке преципитирующих ионов или безуспешной работе механизма их выведения в биологических жидкостях [9]. Эти образования представляют собой самореплицирующиеся кальцийфосфатные частицы ≤ 500 нм в диаметре [9] и могут быть визуализированы при помощи электронной или атомно-силовой микроскопии как сферические наночастицы, формирующие агрегаты и состоящие из углерода, азота, кислорода, водорода, кальция и фосфора [9]. Также было продемонстрировано, что они содержат некоторые белки [9]. В работе было показано, что КФБ схожи между собой при выделении из различных биологических жидкостей [9]. В нашей недавней работе также было продемонстрировано, что КФБ, выделенные из кальцифицированных атеросклеротических бляшек, и искусственно синтезированные КФБ имеют практически одинаковую морфологию и химический состав [1]. Кроме того, было выявлено, что факторы риска развития атеросклероза и кальцификации клапанов сердца аналогичны тем, что способствуют формированию КФБ в крови [1]. Это указывает на их возможную патогенность и роль в появлении сердечно-сосудистой кальцификации. В то же время остается неясным, являются ли КФБ патогенными частицами и истинной причиной сердечно-сосудистой кальцификации или это всего лишь безвредный продукт фосфорно-кальциевого гомеостаза. Было предположено, что КФБ способны оказывать токсические эффекты на эндотелиальные клетки. Цель исследования - оценить токсичность КФБ для эндотелия in vitro и in vivo. Материалы и методы исследования Искусственный синтез КФБ Готовились базовые растворы CaCl2 (0,45М, Sigma-Aldrich) и Na2HPO4·12H2O (0,2M, Sigma-Aldrich), которые далее разбавлялись до равных концентраций в 1 мМ во флаконе с 10 мл культуральной среды (среда DMEM, 10%-ная фетальная бычья сыворотка, 1%-ный раствор L-глутамина-пенициллина-стрептомицина и 0,4%-ный раствор амфотерицина B, Gibco) и инкубировались при 37 °C, 5%-ном CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo). Все процедуры осуществлялись в стерильных условиях. Длительность культивирования составила 6 недель, после чего растворы инкубировались в течение 3 дней при 4 °C, центрифугировались при 200 000 xg (Optima MAX-XP Ultracentrifuge, Beckman Coulter) в течение 1 ч при 4 °C, и осадок растворялся в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, 1x, pH 7,4, Gibco). Количество КФБ в растворе определялось измерением оптической плотности (ОП) на длине волны 650 нм в соответствии со стандартами МакФарланда (0,5; 1 и 2 МкФ с соответствующими значениями ОП 0,08-0,10; 0,14-0,17 и 0,27-0,31). Во всех экспериментах для измерения ОП использовался микропланшетный ридер «Униплан» (Пикон, Россия). Культивирование клеток Для экспериментов с клетками использовалась эндотелиальная клеточная линия EA.hy 926, предоставленная Dr. Cora-Jean S. Edgell (University of North Carolina at Chapel Hill, США) и первичная культура фибробластов кожи человека (пассаж 5/6), выделенная из кожи нижней конечности здорового взрослого человека. Клеточная линия EA.hy 926 является гибридомой, которая была получена путем слияния эндотелиальных клеток пупочной вены человека с клетками аденокарциномы легкого линии A549 и сохраняет основные морфологические и функциональные особенности венозных эндотелиальных клеток человека [3]. Клетки культивировались в среде DMEM/F12 (Sigma-Aldrich) с 10%-ной фетальной телячьей сывороткой (Gibco), 2%-ным раствором гипоксантина-аминоптерина-тимидина (Sigma-Aldrich), 1%-ным раствором HEPES-буфера (Gibco), 1%-ным раствором L-глутамина-пенициллина-стрептомицина (Gibco) и 0,4%-ным раствором амфотерицина B (Gibco). Все эксперименты с клетками проводились в стерильных условиях при 37 °C, 5%-ном CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo). Животные Четырнадцать крыс-самцов породы Wistar (вес 250-300 г, возраст 12-14 недель) использовались для экспериментов на животных. Животные содержались в полипропиленовых клетках (пять крыс на клетку), выстланных деревом, и имели доступ к воде и пище ad libitum. В течение всего времени эксперимента поддерживались стандартные условия температуры (24 ± 1 °C), относительной влажности (55 ± 10 %) и 12-часовые циклы света и темноты. Осмотр крыс проводился ежедневно. Все процедуры осуществлялись в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных и были одобрены этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний». Анализ интернализации КФБ Клетки EA.hy 926 в 6-луночных планшетах (2·105 клеток на лунку) экспонировались 100 µл КФБ (2 МкФ) или ФСБ в течение 48 ч. Осадок клеток фиксировался в течение 1 ч 2,5%-ным глутаровым альдегидом (Sigma-Aldrich), постфиксировался в течение 1 ч 1%-ным тетраоксидом осмия (Serva Electrophoresis), заключался в 2%-ную агарозу (Amresco) и обезвоживался в батарее спиртов возрастающей концентрации. Срезы агарозного геля заключались в смесь эпоксидной смолы и ацетона (соотношение 1:1, Sigma-Aldrich) при комнатной температуре на 2 ч, затем снова заключались в эпоксидную смолу при комнатной температуре на сутки и наконец заключались в свежую эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы производились на ультрамикротоме (LKB Bromma Nova Ultra Microtome, LKB), помещались на медную сеточку с углеродным напылением (Structure Probe, Inc.), окрашивались 2%-ным уранилацетатом (Electron Microscopy Sciences) и контрастировались цитратом свинца (Electron Microscopy Sciences). Далее срезы оценивались при помощи просвечивающего электронного микроскопа (JEOL JEM-2100, JEOL). Аннексин V/7-аминоактиномицин D-тест Клетки EA.hy 926 и первичные фибробласты кожи человека в 6-луночных планшетах (2·105 клеток на лунку) экспонировались 100 мкл КФБ (0,5 или 2 МкФ) или ФСБ в течение 24 ч. Аннексин V/7-аминоактиномицин D-тест для определения апоптоза/некроза проводился с использованием набора компании BioLegend в соответствии с инструкциями производителя, оценка результатов проводилась проточной цитометрией (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, BD Biosciences). Для анализа данных проточной цитометрии использовалась программа FCAP Array (Soft Flow). Все измерения осуществлялись в дублях, и средние значения использовались для последующего анализа. 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (MTT)-тест Клетки EA.hy 926 и первичные фибробласты кожи человека в 96-луночных планшетах (2·104 клеток на лунку) экспонировались 10 мкл КФБ (0,5 или 2 МкФ) или ФСБ в течение 24 ч. MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид)-тест для оценки клеточной жизнеспособности и пролиферации проводился при помощи соответствующего набора компании Life Technologies в соответствии с инструкциями производителя, измерение результата осуществлялось на длине волны 570 нм. Иммуноферментный анализ Клетки EA.hy 926 и первичные фибробласты кожи человека в 6-луночных планшетах (2·105 клеток на лунку) экспонировались 100 мкл КФБ (0,5 или 2 МкФ) или ФСБ в течение 24 ч. Уровень цитокинов и молекул клеточной адгезии (интерлейкин-1α, -4, -6, -8, растворимый CD40-лиганд, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, растворимый E-селектин, растворимый P-селектин, растворимая межклеточная молекула клеточной адгезии-1, интерферон-γ и фактор некроза опухоли-α) в надосадке с клеточных культур измерялся методом иммуноферментного анализа посредством наборов компании eBioscience в соответствии с инструкциями производителя. Все измерения проводились в дублях, и средние значения использовались для последующего анализа. Измерение результата выполнялось на длине волны 450 нм. Животная модель После анестезии 3%-ным изофлураном все животные получали ингаляционную анестезию 1,5%-ным изофлураном в течение всего времени операции. Использовалась оригинальная экспериментальная модель ангиопластики аорты крысы с применением баллона для коронарной ангиопластики [6]. Аорта пунктировалась в проксимальном направлении иглой 21G, баллонный катетер DIOR 2,0×15 мм вставлялся в просвет аорты при помощи 0,014-дюймового проводника, и проводилась ангиопластика с давлением 10 атмосфер в течение 10 секунд. Катетер выводился, и процедура повторялась трижды для повреждения эндотелия. Все процедуры выполняли в асептических условиях. Раствор КФБ (700 мкл, 0,5 МкФ) или такой же объем 0,9%-ного NaCl (Gibco) вводился в кровеносное русло опытных и контрольных крыс соответственно (по 7 животных) путем инъекции в хвостовую вену. Забор тканей, окраска и гистологический анализ Спустя пять недель после операции все животные умерщвлялись передозировкой углекислого газа. Сегменты брюшной аорты крыс (≥ 2,5 см) иссекались, фиксировались в 10%-ном забуференном формалине (Electron Microscopy Sciences), заключались в парафин (Electron Microscopy Sciences), и производились срезы (3 мкм). После окраски гематоксилин-эозином и по ван Гизону в соответствии с общепринятой методикой срезы с каждой аорты оценивались световой микроскопией (Axioscop 40 Lab Microscope, Carl Zeiss) для определения гиперплазии интимы и отношения интимы к медии. Ширина интимы и медии оценивалась с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health). Оценивалось по три среза каждой окраски с каждой крысы, и вычислялось среднее значение для статистического анализа. Статистический анализ Статистический анализ проводился при помощи программы MedCalc (MedCalc Software). Оценка нормальности распределения оценивалась по критерию д’Агостино-Пирсона. Данные представлялись с помощью медианы, межквартильного расстояния (25-й и 75-й процентили), среднего и доверительных интервалов (ДИ) для медианы и среднего. В зависимости от типа распределения две независимые группы сравнивались по U-критерию Манна-Уитни или t-критерию Стьюдента, три и более независимые группы сравнивались по критерию Краскелла-Уоллиса или однофакторным дисперсионным анализом (ОДА) с последующим попарным сравнением по U-критерию Манна-Уитни или t-критерию Стьюдента в том случае, если статистически значимые различия были выявлены критерием Краскелла-Уоллиса или ОДА соответственно. Поправка на множественные сравнения проводилась вычислением средней доли ложных отклонений гипотез (false discovery rate). P-значения или q-значения в случае вычисления средней доли ложных отклонений гипотез (q-значения - это p-значения после поправки с использованием этого метода) ≤ 0,05 признавались статистически значимыми. Результаты и их обсуждение Поскольку КФБ могли быть замечены в клеточных культурах методом фазово-контрастной микроскопии (рис. 1, a), была исследована возможность интернализации КФБ клетками линии EA.hy 926. Данное явление было успешно выявлено при помощи просвечивающей электронной микроскопии (рис. 1, б). Затем была исследована способность КФБ вызывать цитотоксические эффекты, т.е. индуцировать апоптоз и снижать жизнеспособность. Аннексин V/7-аминоактиномицин D-тест показал, что доля клеток, подвергшихся позднему апоптозу/некрозу, статистически значимо выше, в то время как доля живых клеток статистически значимо ниже в культурах клеток EA.hy 926, экспонированных КФБ в течение 24 часов, в сравнении с контрольными культурами (рис. 2, а); последнее также было подтверждено посредством MTT-теста (рис. 2, б). Стоит отметить, что не было обнаружено никакой дозозависимой связи при добавлении к клеткам растворов с КФБ одинакового объема, но разной оптической плотности (0,5 или 2 МкФ) (рис. 2, а, б). Далее был применен иммуноферментный анализ для оценки уровня про-атеросклеротических цитокинов и молекул клеточной адгезии в надосадке с клеточных культур. Уровень интерлейкина-6 и интерлейкина-8 был статистически значимо выше в надосадке с культур линии EA.hy 926, экспонированных КФБ в течение 24 часов, в сравнении с контрольными культурами (рис. 2, в). Кроме того, не удалось обнаружить значимых цитотоксических эффектов или изменений секреторного профиля в экспериментах на первичных культурах фибробластов кожи человека. Наконец была оценена способность КФБ вызывать гиперплазию интимы in vivo. Она была обнаружена у шести из семи крыс, экспонированных КФБ, и лишь у трех из семи контрольных крыс. Более того, была выявлена значительная концентрическая или эксцентрическая гиперплазия интимы брюшной аорты у трех крыс, экспонированных КФБ, но не у контрольных крыс (рис. 3, а, б). Отношение интимы к медии в стенке брюшной аорты также было статистически значимо выше у крыс, экспонированных КФБ, в сравнении с контрольными крысами (рис. 3, в). а б Рис. 1. Интернализация кальцийфосфатных бионов эндотелиальными клетками: а - КФБ присутствуют среди клеток EA.hy 926, экспонированных им (справа), но не в контрольной культуре (слева); б - КФБ интернализируются клетками EA.hy 926, экспонированными им (справа); контрольная культура свободна от КФБ (слева) 3.tif Рис. 2. Токсичность кальцийфосфатных бионов для эндотелиальных клеток in vitro: а - КФБ способны индуцировать апоптоз и снижать жизнеспособность клеток EA.hy 926 независимо от дозы; б - клетки EA.hy 926, экспонированные КФБ, менее жизнеспособны; в - экспозиция КФБ увеличивает синтез интерлейкина-6 и интерлейкина-8 клетками EA.hy 926; *p < 0,05, **p < 0,01 4.tif Рис. 3. Токсичность кальцийфосфатных бионов для эндотелиальных клеток in vivo: а - окраска гематоксилин-эозином показывает значительную гиперплазию интимы брюшной аорты крыс, экспонированных КФБ (справа), но не контрольных крыс (слева); б - окраска по ван Гизону также показывает значительную гиперплазию интимы брюшной аорты крыс, экспонированных КФБ (справа), но не контрольных крыс (слева); в - отношение интимы к медии выше в брюшной аорте крыс, экспонированных КФБ, в сравнении с контрольными крысами; *p < 0,05 Таким образом, в данной работе показано, что КФБ обладают эндотелиотоксичностью. Они способствуют апоптозу и снижают жизнеспособность эндотелиальных клеток, индуцируют синтез интерлейкина-6 и интерлейкина-8, являющихся проатеросклеротическими цитокинами [2, 4], а также вызывают гиперплазию интимы in vivo. Эти эффекты могут быть обусловлены интернализацией данных частиц эндотелиальными клетками. В то же время представленные эксперименты имеют ряд ограничений. Во-первых, клеточная линия EA.hy 926 является гибридомой, которая была получена путем слияния эндотелиальных клеток пупочной вены человека с клетками аденокарциномы легкого линии A549 [3]. Хотя она сохраняет основные морфологические и функциональные особенности венозных эндотелиальных клеток человека [3], это все же: 1) венозные, а не артериальные эндотелиальные клетки; 2) они потеряли способность синтезировать некоторые молекулы клеточной адгезии, что затрудняет оценку их секреторного профиля. В то же время у гибридомы есть как минимум одно преимущество: она значительно более резистентна к цитотоксическим агентам. Поэтому можно сделать вывод, что КФБ на самом деле обладают цитотоксическим действием. Во-вторых, возможно, что эндотелиотоксичность КФБ обусловлена обыкновенным физическим повреждением клеточных мембран или органелл, которое может быть вызвано также и другими бионами. Хотя в теории это и возможно, не существует доказательств того, что атеросклероз может быть ассоциирован с перенасыщением элементами, отличными от кальция и фосфора. Поэтому включать другие бионы в дизайн данного исследования было нерелевантно. Таким образом, все эксперименты подтверждают гипотезу о том, что КФБ оказывают токсические эффекты на эндотелиальные клетки, что, в свою очередь, определяет их патогенность, поскольку это одно из главных звеньев в развитии атеросклероза [8]. Полученные данные согласуются с результатами предыдущих исследований [5, 7, 10, 11], которые обнаружили выраженную цитотоксичность КФБ для других клеточных линий. Кроме того, помимо прямой цитотоксичности, КФБ также способствуют выработке интерлейкина-6 и интерлейкина-8, которые известны как проатеросклеротические цитокины [2, 4]. Поэтому КФБ могут быть начальным триггером атеросклероза и способствовать развитию местного воспаления путем индукции синтеза проатеросклеротических цитокинов. Будущие исследования по патогенности КФБ должны быть сфокусированы на их цитотоксических эффектах. В отношении эндотелиотоксичности было бы полезно исследовать этот механизм на артериальных эндотелиальных клетках для лучшего понимания: 1) влияния КФБ на секреторный профиль данных клеток; 2) путей апоптоза после экспозиции КФБ. Это может помочь в понимании развития атеросклероза, особенно его начального триггера. В то же время следует также сфокусироваться на других возможных механизмах патогенности КФБ, которыми могут быть прямая кальцификация и изменение конформации антикальцифицирующих белков. Выводы 1. КФБ интернализируются эндотелиальными клетками. 2. КФБ способствуют апоптозу и снижают жизнеспособность эндотелиальных клеток. 3. КФБ индуцируют синтез интерлейкина-6 и интерлейкина-8, являющихся проатеросклеротическими цитокинами. 4. КФБ вызывают гиперплазию интимы in vivo. 5. Таким образом, КФБ обладают токсическим действием на эндотелиальные клетки.

About the authors

A G Kutikhin

Email: antonkutikhin@gmail.com

E A Velikanova

D E Filipiev

R A Mukhamadiyarov

V G Matveeva

L V Antonova

A S Golovkin

D M Russakov

E V Grigoriev

E B Brusina

O L Barbarash

References

Supplementary files