Role of vasculoendothelial growth factor and its gene in pathogenesis of hepatobiliary pathology

Full Text

Введение

Хронические заболевания печени закономерно прогрессируют до цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы, которые являются третьей причиной смерти среди лиц старше 50 лет в Европе. Важнейшая роль при этом отводится ангиогенезу и нарушению сосудистой архитектоники в печени, что ведет к портальной гипертензии, нарушению перфузии гепатоцитов и развитию фатальных осложнений цирроза. Ангиогенез также играет ключевую роль в росте опухолей, в том числе в развитии гепатоцеллюлярной карциномы, которая обычно возникает на фоне ЦП [1]. В патогенезе любого поражения печени не менее важное значение имеет развитие фиброза [2]. Васкулоэндотелиальный фактор роста (ВЭФР) является молекулой, которая объединяет процессы ангиогенеза и фиброза, так как этот цитокин стимулирует, особенно в условиях гипоксии, пролиферацию звездчатых клеток печени и продукцию ими коллагена [3]. ВЭФР также является митогеном эндотелиальных клеток и маркером повреждения эндотелия, в том числе при развитии эндотелиальной дисфункции на фоне хронических диффузных заболеваний печени при воздействии различных этиологических факторов поражения (гепатотропные вирусы, алкоголь и др.) [4]. Необходимость генетических исследований, в том числе при хроническом гепатите С (ХГС), для прогностических целей диктуется рекомендациями Европейской ассоциации по изучению печени [5].

Цель исследования – оценить патогенетическое значение ВЭФР и его гена при гепатобилиарной патологии.

Материалы и методы исследования

Обследовано 190 пациентов с гепатобилиарной патологией (ГПБ): 100 больных ХГС в фазе реактивации, 50 – с ЦП в исходе ХГС, 30 – с желчнокаменной болезнью (ЖКБ), 10 – с очаговыми поражениями печени (в том числе 8 с первичными и вторичными опухолями печени). Группу контроля составили 34 практически здоровых человека, для исследования однонуклеотидного полиморфизма гена ВЭФР в популяции обследовано 100 человек. Больные были обследованы на базе Клинической медико-санитарной части № 1, Пермской краевой инфекционной больницы, городского гепатологического центра, Краевой клинической больницы на станции Пермь-II. Исследование имело параллельный дизайн, было простым, открытым, контролируемым. При формировании групп наблюдения использовался метод адаптивной рандомизации. Было получено письменное информированное согласие пациентов на участие в исследовании. Помимо общеклинического обследования, оценки функциональных печеночных проб, определения серологических маркеров вирусных гепатитов методом ИФА, ПЦР с целью индикации HCV-РНК, определения генотипа вируса, уровня вирусной нагрузки, пациентам проводили инструментальные методы – УЗИ печени, желчного пузыря, селезенки, портальной вены, у ряда больных осуществлено гистологическое исследование печени. Тесты оценки функционального состояния эндотелия изучали в сыворотке крови методом ИФА: уровень общего оксида азота (ОА) – с использованием набора SYSTEMS (США); эндотелина-1 (ЭТ-1) – с использованием набора BIOMEDICA CRUPPE (США); ВЭФР – с использованием набора BIOSOURCE (США); количественное определение функциональной активности фактора Виллебранда (ФВ) проводили на агрегометре 230 LA НПФ «Биола» (г. Москва) (НПО «Ренам», г. Москва). Подсчитывали количество десквамированных эндотелиоцитов (ДЭЦ) в плазме крови по методу Hladovec, 1978 (Н.Н. Петрищев, 2001). Выраженность фиброза печени оценивали путем определения гиалуроновой кислоты (ГК) в сыворотке крови методом ИФА с помощью тест-системы ВСМ Diagnostics (США). Однонуклеотидные полиморфные варианты гена определяли в крови с использова- нием аллельспецифической ПЦР «SNP-Скрин» ЗАО «Синтол» (г. Москва) с детекцией продуктов в режиме реального времени на амплификаторе CFХ-96, Bio-Rad Laboratories, Inc (США).

Статистическая обработка результатов исследования выполнена с использованием пакетов программ Statistica 6,0, 7,0 Microsoft и Office Excell 2010. При нормальном распределении признака результаты описаны в виде среднего арифметического (М) ± одно среднее квадратичное стандартное отклонение (σ). Для сравнения групп по количественным признакам при нормальном распределении применен дисперсионный анализ Стьюдента для независимых групп. Связь признаков оценивалась при помощи регрессионного анализа с определением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Нулевая гипотеза отвергалась, и различия между выборками считались статистически достоверными при значении р < 0,05. Проводилась оценка операционных характеристик тестов оценки функционального состояния эндотелия – диагностической чувствительности, диагностической специфичности. Для описания соотношения частот генотипов и аллелей изучаемых генов использовали равновесие Харди – Вайнберга. Исследуемые группы находились в равновесном (устойчивом) состоянии по частотам генотипов изученного гена (р > 0,05). Для частотного анализа использовался метод χ2. Различия в двух популяциях рассчитывались по отношению шансов (OR) с использованием подхода «случай – контроль» для различных моделей наследования: аддитивной, общей, мультипликативной, доминантной и рецессивной и считались достоверными при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

Для оценки роли ВЭФР в патогенезе заболеваний гепатобилиарной системы анализировали этот цитокин в рамках синдрома эндотелиальной дисфункции (ЭД) как общепатологического процесса при хроническом поражении печени. При исследовании комплекса лабораторных тестов функционального состояния эндотелия в целом при ГБП выявлены достоверные отличия от показателей контрольной группы, что свидетельствует о наличии поражения эндотелия на фоне ХГ, ЦП и ЖКБ (табл. 1). Дисфункция эндотелия проявлялась достоверным снижением уровня выработки ОА в сочетании с повышением концентрации Эт-1.

Эти изменения указывают на дисбаланс соединений, влияющих на тонус сосудов, что ведет к ухудшению кровообращения и предрасполагает к формированию на ранних этапах функциональной портальной гипертензии. Количество ДЭЦ было достоверно увеличено, что в сочетании с повышением выработки ВЭФР до 297,8 ± 115,1 пг/мл (р = 0,001) подтверждает наличие выраженного повреждения сосудистого эндотелия при ГПБ. При этом ВЭФР маркирует активацию неоангиогенеза в печени на фоне воспалительного процесса и фиброза при ХГ и ЦП. Активность ФВ как маркера повреждения эндотелия у всех обследованных была также достоверно повышена, что подтверждает повреждение эндотелия при патологии печени.

 

Таблица 1

Показатели функционального состояния эндотелия у больных гепатобилиарной патологией (M ± s)

Показатель	Контрольная группа, n = 34	ГБП, n = 180	р
OА, мкмоль/л	29,43 ± 3,34	15,8 ± 3,7	<0,001
Эт-1, фмоль/л	0,3 ± 0,13	0,74 ± 0,18	<0,001
ДЭЦ, 104/л	3,02 ± 1,21	7,01 ± 1,92	<0,001
ВЭФР, пг/мл	158,86 ± 72,83	297,8 ± 115,1	<0,001
ФВ,%	80,1 ± 9,8	111,1 ± 14,8	<0,001

 

Примечание: р – значимость различий в сравниваемых группах.

 

Проанализированы маркеры поражения эндотелия в группах больных ХГ, ЦП и ЖКБ. Достоверное снижение при ХГ и ЦП уровня ОА сочеталось с повышением концентрации Эт-1, причем этот дисбаланс был более значимым при ЦП. У больных ЖКБ также выявлено снижение выработки ОА, но концентрация Эт-1 не отличалась значимо от таковой у здоровых. Увеличение количества ДЭЦ было отмечено во всех группах пациентов, максимально выраженное при ЦП. Более выраженное увеличение концентрации этого пептида наблюдалось при ЦП по сравнению с ХГ, что свидетельствует об активации неоангиогенеза в печени и при ЦП является маркером перестройки сосудистой архитектоники органа [6]. Медиана концентрации ВЭФР сопоставима у пациентов с ЖКБ и ХГ (265,0 ± 262,9 и 249,5 ± 94,5 нг/мл соответственно), но из-за большого разброса показателей в группе ЖКБ отличия от контрольной группы были не достоверны. Тем не менее повышение ВЭФР у ряда больных ЖКБ свидетельствует о развитии вторичного гепатита на фоне хронического воспалительного процесса в желчевыводящих путях, который по результатам морфологического исследования печени диагностирован у всех пациентов данной группы. В 83 % случаев была выявлена минимальная степень активности хронического гепатита, у 17 % – умеренная степень активности. При ХГ концентрация ВЭФР достигла 249,5 ± 94,5 нг/мл, у больных ЦП – 375,0 ± 116,6 нг/мл, отличие от группы контроля составило 0,003 и < 0,001 соответственно. На фоне ОПП повышение уровня ВЭФР составило 335,9 ± 198,2 нг/мл и имело достоверные различия с контрольной группой, что может характеризовать не столько выраженность ЭД, сколько интенсивность опухолевого роста. Другие тесты ЭД были близки аналогичным результатам при хронических вирусных заболеваниях печени, достоверных отличий с ХГС и ЦП не выявлено. Таким образом, у пациентов с хроническими заболеваниями печени концентрация ВЭФР была достоверно увеличена, более выраженное повышение имело место при ЦП по сравнению с ХГ, что свидетельствует о более тяжелом повреждении эндотелия при развитии цирроза и более активной стимуляции неоангиогенеза в печени. Эти результаты соответствуют данным других авторов, изучавших уровень ВЭФР при ХГ и ЦП [7].

Так как группы больных с ГБП не сопоставимы по возрасту и полу, для исключения возможного наличия у больных заболеваниями печени зависимости эндотелиальных нарушений от возраста и пола в группах проведен корреляционный анализ маркеров ЭД, возраста и пола, но достоверных взаимосвязей не было найдено [6].

Изучены взаимосвязи маркеров ЭД в группах пациентов с ГБП. При этом установлено наличие обратной достоверной взаимосвязи между уровнем ОА, содержанием Eт-1, ВЭФР, ФВ и количеством ДЭЦ. То есть чем более выражена ЭД, основным проявлением которой является снижение выработки ОА эндотелием, тем выше показатели, маркирующие непосредственное повреждение эндотелия как при ХГ и ЦП, так и при ЖКБ. У пациентов с ЖКБ между ВЭФР, выработка которого достоверно не отличается от показателей здоровых, и данными ЭД взаимосвязи отсутствуют. При ХГ ВЭФР имеет прямые достоверные корреляции с ДЭЦ и ФВ, у больных ЦП в дополнение – обратная корреляция с ОА. Таким образом, наличие достоверных связей между OА, Эт-1, ДЭЦ, ВЭФР и ФВ подтверждает достоверность этих показателей как маркеров патологии эндотелия при ГБП. При этом большее количество сильных взаимосвязей между маркерами поражения эндотелия, в том числе ВЭФР, выявлено у пациентов с ЦП.

Известно, что при вирусных заболеваниях печени отмечается вовлечение эндотелия в формирование ответной реакции на репликацию вируса. Ряд механизмов реализуется за счет синтеза OА, который обеспечивает защитные свойства эндотелия, связанные с элиминацией возбудителя, но, кроме того, обусловливает и ряд патологических реакций, связанных с расширением сосудов и их экспансией в ткань печени. Изменение функционального состояния эндотелия может приводить к нарушениям печеночной гемодинамики на фоне уменьшения вазодилатирующего потенциала эндотелия за счет дисбаланса между выработкой эндотелием вазоактивных соединений, а также свидетельствовать о процессах перестройки сосудистой системы печени и ослаблении атромбогенного потенциала сосудистого эндотелия.

Показатели фиброза демонстрировали следующие изменения: концентрация ГК была достоверно повышена при ХГ и особенно при ЦП по сравнению с данными группы контроля, между группами пациентов также были достоверные различия. Коэффициент де Ритиса (соотношение АСТ/АЛТ) – при ХГ был меньше единицы и не отличался от показателей контрольной группы, а при ЦП был существенно выше, чем у здоровых и пациентов с ХГ (табл. 2).

В группе ОПП уровень ГК был достоверно повышен и составил 241,4 ± 252,0 нг/мл, при этом медиана занимала промежуточное положение между показателями при ХГ и ЦП, хотя из-за большой вариабельности и малой группы достоверных различий не выявлено. Параллелизм повышения ВЭФР, ГК и соотношения АСТ/АЛТ подтверждает возможность использования определения этого цитокина в качестве непрямого маркера фиброза печени и теста дифференциации ХГ и ЦП, что подтверждается и результатами корреляционного анализа (табл. 3).

Проведено изучение взаимосвязей между концентрацией ВЭФР и показателями функциональных печеночных проб при ХДЗП, которые в большинстве случаев продемонстрировали достоверные корреляции (табл. 3).

В группе пациентов с ХГ выявлены достоверные корреляции маркеров функционального

 

Таблица 2

Показатели ГК и АСТ/АЛТ в группах с ХГ и ЦП

Показатель	Контрольная группа	Больные ХГ	Больные ЦП	р1	р2	р3
ГК, нг/мл	17,8 ± 17,0	70,38 ± 52,8	506,5 ± 388,2	0,02	0,007	< 0,001
АСТ/АЛТ	0,8 ± 0,12	0,83 ± 0,4	2,37 ± 1,80	0,1	0,02	< 0,001

 

Примечание: р₁ – значимость различий в группах здоровых и больных ХГ; р₂ – в группах здоровых и больных ЦП; р₃ – значимость различий в группе больных ХГ и ЦП.

 

Таблица 3

Взаимосвязи ВЭФР, показателей функциональных проб печени, тромбоцитарного гемостаза, тестов фиброза при ХГ и ЦП

Показатель	ХГ		ЦП
	r1	p1	r2	p2
ВЭФР и АЛТ	0,11	0,77	0,83	0,001*
ВЭФР и АСТ	0,33	0,16	0,92	0,00002*
ВЭФР и общий билирубин	0,08	0,8	0,9	0,00001*
ВЭФР и ГГТП	0,97	0,005*	0,9	0,006*
ВЭФР и общий белок	–0,97	0,005*	–0,9	0,01*
ВЭФР и ПТВ	–0,4	0,05	–0,89	0,01*
ВЭФВ и ГК	0,5	0,018*	0,8	0,02*
ВЭФР и АСТ/АЛТ	0,4	0,02*	0,9	0,03*
ВЭФР и количество тромбоцитов	–0,07	0,7	–0,94	0,005*
ВЭФР и агрегация тромбоцитов с АДФ	0,11	0,6	0,82	0,04*

 

Примечание: r₁ – корреляции показателей при ХГ; r₂ – корреляции показателей при ЦП; р₁ – значимость корреляций при ХГ; р₂ – значимость корреляций при ЦП; * – корреляции достоверны.

 

состояния эндотелия (ОА, Эт-1, ДЭЦ) с основным тестом цитолиза гепатоцитов – АЛТ). Маркеры повреждения эндотелия также демонстрируют взаимосвязи с показателями холестаза (Щ). При ХГ обнаружена обратная взаимосвязь ВЭФР с общим белком, что свидетельствует о снижении белково-синтетической функции печени при нарастании ЭД. Это может расцениваться как нарастание печеночно-клеточной недостаточности при развитии неоангиогенеза, который ведет к перестройке сосудистой архитектоники печени. Протромбиновое время (ПТВ), удлинение которого является проявлением синдрома печеночно-клеточной недостаточности, имеет обратную корреляцию с маркерами поражения эндотелия, достоверные взаимосвязи тестов характерны для пациентов с ЦП.

При ЦП OА имеет обратную корреляцию с АЛТ, АСТ, билирубином, ЩФ и тимоловой пробой и прямую – с белком и ПТВ. Выявлены также достоверные взаимосвязи Эт-1 с АЛТ, АСТ, билирубином, ЩФ, ГГТП, тимоловой пробой и обратная корреляция с общим белком и ПТВ [4]. Десквамация эндотелия также взаимосвязана с нарушениями функциональных печеночных проб, в том числе со снижением белка и увеличением ПТВ, что свидетельствует о взаимосвязи ЭД и синдрома печеночно-клеточной недостаточности. Аналогичная картина характерна и для других тестов повреждения эндотелия: ВЭФР и ФВ имеют достоверные прямые взаимосвязи с большинством биохимических тестов и обратные – с белком и ПТВ. Количество тромбоцитов демонстрировало положительную взаимосвязь с OА и обратные корреляции с Эт-1, ВЭФР, ФВ при ЦП. Это свидетельствует о взаимосвязи более выраженного поражения эндотелия со снижением количества тромбоцитов у пациентов с ЦП. Показатели агрегации тромбоцитов имели отрицательную зависимость от количества тромбоцитов, что свидетельствует о возрастании агрегационной способности тромбоцитов по мере снижения их количества на фоне ЭД при ЦП. Выявлена положительная взаимосвязь между результатами агрегации со всеми индукторами и показателями ЭД. В группе больных ХГ достоверных корреляций не наблюдалось.

У пациентов с ЦП выявляется большее число корреляций печеночных проб и маркеров ЭД по сравнению с ХГ, что указывает на прогрессирование поражения эндотелия при более тяжелой патологии печени. ВЭФР, как маркер ЭД также демонстрирует связь с прогрессированием патологии печени и непосредственно участвует в патогенезе как фактор неоангиогенеза и перестройки сосудистой архитектоники печени, а также стимулятор развития фиброза в органе.

Для уточнения взаимосвязей уровня вирусной нагрузки (ВН) с состоянием эндотелия и процессами фиброзирования печени обследовано 40 пациентов с ХГС в фазе реактивации (мужчин 58 %, женщин 42 %). Вирусемия достоверно коррелировала с показателями повреждения эндотелия, то есть чем выше уровень ВН, тем больше десквамация эндотелия. Эти результаты подтверждают цитопатическое действие вируса гепатита С на эндотелий. ВН также логично взаимосвязана с выработкой ВЭФР (р = 0,001), который в свою очередь запускает процессы неоангиогенеза и способствует перестройке сосудистой архитектоники печени. В результате исследования выявлены сильные взаимосвязи между вирусемией и маркерами фиброза печени: уровень ВН достоверно коррелирует с ГК (р = 0,0015) и соотношением АСТ/АЛТ (р = 0,007). То есть чем выше вирусная нагрузка, тем активнее запускаются процессы выработки губой соединительной ткани в печени. Поражение эндотелия в этом процессе играет непосредственное участие, прежде всего через Эт-1, который активирует звездчатые клетки печени, вырабатывающие соединительную ткань. Это подтверждается и достоверными взаимосвязями между маркерами фиброза и поражения эндотелия, выявленными ранее: отрицательной корреляцией ГК и OА и положительными взаимосвязями ГК с Эт-1, ВЭФР. Аналогичные достоверные корреляции выявлены и при изучении взаимосвязей отношения АСТ/АЛТ и OА, Эт-1, ДЭЦ, ВЭФР. Выработка ВЭФР при ХГС взаимосвязана с уровнем ВН и непосредственно участвует в патогенезе этого заболевания и прогрессировании поражения печени при инфицировании вирусом гепатита С.

Так как у пациентов с ХГ выявлены достоверные взаимосвязи средней силы, при ЦП – сильные взаимосвязи ВЭФР с маркерами фиброза, это подтверждает его значение как непрямого маркера фиброза печени. При оценке операционных характеристик ВЭФР установлена способность теста поражения эндотелия стратифицировать ХГ и ЦП. Полученные результаты близки к данным эффективности ГК и АСТ/АЛТ для диагностики выраженного фиброза/цирроза при найденных точках разделения (табл. 4). Определение ВЭФР является информативным тестом, который при точке разделения 312,3 пг/мл может с эффективностью 82 % использоваться для дифференциальной диагностики минимального и умеренного фиброза печени при ХГ и выраженного фиброза у пациентов с ЦП.

По данным литературы, точку разделения 115 пг/мл для прогнозирования развития хронического гепатита можно использовать со специфичностью 67 % и чувствительностью 79 %, но любой уровень не мог предсказать развитие ЦП. Возможно, такие данные связаны с обследованием малых групп больных: 34 – с ХГС и 10 – с ЦП [7].

Приводим клинический пример диагностического значения ВЭФР. Больная А., 32 года. Диагноз: хронический гепатит С, фаза реактивации, генотип 1b. Жалобы: слабость, снижение аппетита, нарушение сна. Анамнез: диагноз установлен в 2004 г. В анамнезе – роды и переливание крови в 2000 г. Объективно: печень +1 см, мягкая, безболезненная. УЗИ: незначительные диффузные изменения в печени. Биохимический анализ крови 26.01.05 г.: билирубин – 12,4, АЛТ – 95 ед/л, АСТ- 87 ед/л, тимоловая проба – 4,4 ед. Концентрация ВЭФР составила 290,5 пг/мл, что характерно для ХГ.

При изучении комбинаций аллельных вариантов гена васкулоэндотелиального фактора роста VEGFA (G-634C) в позиции rs2010963 у здоровых преобладал генотип GС в 57,58 % (χ² = 6,4; р = 0,04) (рисунок).

При этом гомозигота СС была найдена только  в  группе  пациентов с ХГС в 12,5 %

 

Таблица 4

Операционные характеристики лабораторных тестов ВЭФР и фиброза печени у больных ХГ и ЦП

Тест	Точка разделения	Чувствительность, %	Специфичность, %	Эффективность, %
ВЭФР, пг/мл	312,3	90	78	82
ГК, нг/мл	100,0	100	80	88
АСТ/АЛТ	1,5	69	96	82

 

 

Рис. Частота обнаружения аллельных пар в полиморфных локусах гена VEGFA (G-634C) в анализируемых когортах здоровых и больных

 

с высокой вероятностью (QR = 1,15), а в популяции здоровых не обнаруживалась (χ² = 4,55; р = 0,001). Достоверных различий в частоте встречаемости минорного аллеля С гена VEGFA (G-634C) в исследуемых группах не было найдено (28,79 и 31,77 %; χ² = 0,20; р = 0,65; QR = 1,14).

Таким образом, в плане прогнозирования предрасположенности к хронизации гепатита С значимо носительство аллеля риска С в локусе гена VEGFA (G-634C) в виде гомозиготы СС. Минорный аллель С гена VEGFA (G-634C) ассоциирован с мужским полом, что подтверждает известные данные о связи мужского пола с тяжестью поражения печени при ХГ [5]. При анализе гена VEGFA в локусе G-634C наблюдалась взаимосвязь с увеличением выработки ВЭФР (р = 0,035), участвующего в активации механизмов неоангиогенеза и сосудистой перестройки, эндотелиальной дисфункции, ведет к портальной гипертензии и стимулирует прогрессирование фиброза. Это подтверждает нашу гипотезу о возможном негативном влиянии полиморфизмов генов патогенетически значимых молекул на характер течения заболевания и должно учитываться при прогнозировании течения ХГС [8].

Выводы

1. При гепатобилиарной патологии ВЭФР как показатель неоангиогенеза и ЭД является маркером тяжести поражения печени: его выработка повышена у ряда больных ЖКБ, умеренно повышена у всех пациентов с ХГ и значительно повышена на фоне ЦП и ОПП опухолевого генеза.
2. При хронических диффузных заболеваниях печени выявлены многочисленные достоверные взаимосвязи ВЭФР с рядом показателей ЭД, печеночными клинико-биохимическими синдромами, маркерами фиброза печени, уровнем вирусной нагрузки, что свидетельствует об облигатном участии ВЭФР в развитии и прогрессировании патологии печени.
3. ВЭФР может использоваться как тест дифференциальной диагностики фиброза при ХГ и ЦП с чувствительностью 90 % и специфичностью 78 %.
4. Носительство аллеля С в локусе гена VEGFA (G-634C) в виде гомозиготы СС может свидетельствовать о риске более тяжелого поражения печени при ХГС и взаимосвязано с увеличением выработки ВЭФР. Таким образом, ВЭФР и полиморфизм его гена облигатно участвуют в патогенезе ГБП, активируя неоангиогенез и фиброз в печени.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A. P. Schekotova

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: al_shchekotova@mail.ru

MD, PhD, Professor, Department of Faculty Therapy №2, Professional Pathology and Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Perm

I. A. Bulatova

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: al_shchekotova@mail.ru

MD, PhD, Professor, Department of Faculty Therapy №2, Professional Pathology and Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files