GENETIC CONTROL PECULIARITIES OF BIOFILM FORMATION IN ACINETOBACTER GENUS BACTERIA

Full Text

Введение В медицинских учреждениях, оказывающих высокотехнологичные виды помощи, ведущими возбудителями госпитальных инфекций являются ESCAPE-патогены, в том числе Acinetobacter baumannii [5]. В настоящее время особую опасность представляют карбапенемоустойчивые штаммы пандемических линий [11]. Возбудители в форме биопленки способны контаминировать как биотические, так и абиотические субстраты, например, сосудистые катетеры, и приводить к развитию катетерассоциированных инфекций кровотока [3]. Внутри биопленок сесильные бактерии, как правило, отличаются повышенной резистентностью к антибиотикам [2]. Способность бактериальных клеток к биопленкообразованию на гидрофильных (например, стекле) или гидрофобных (например, пластик) субстратах определяется экспрессией ряда независимых или связанных между собой генетических элементов, в числе которых оперон pgaABCD, участвующий в синтезе и транспорте внеклеточного полисахарида поли-бета-(1-6)-N-ацетилглюкозамина (PNAG) [9, 14]. Благодаря способности продуцировать PNAG ацинетобактер может образовать плотную (тугую) биопленку и на границе раздела фаз «воздух-жидкость» при координации процесса с экспрессией генетического комплекса csuA/B, контролирующего шаперон-ашерную сборку пилей [5, 9]. У A. baumannii ген pgaA кодирует белок наружной мембраны (812 аминокислотных остатков), который лишь на 26 % идентичен PgaA у Escherichia coli. PgaA состоит из поринового и периплазматического доменов, что обеспечивает трансмембранный перенос PNAG. Ген pgaB кодирует деацетилазу, катализирующую удаление ацетильной группы при транслокации PNAG. Ген pgaC в составе оперона кодирует N-гликозилтрансферазу второго семейства (424 аминокислотных остатка), а белок-продукт гена pgaD находится в цитоплазме и, по-видимому, действует координированно с PgaC [14]. Сравнительный генетический анализ показал, что оперон pgaABCD среди эубактерий скорее всего переносится горизонтально [7]. Отсюда цель данного исследования - определить методами in silico степень полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей оперона у патогенных и природных видов/штаммов ацинетобактера и подтвердить или опровергнуть факт горизонтального генетического переноса извне. Материалы и методы исследования В числе объектов исследования - представители рода Acinetobacter, выделенные из клинического материала и природных образцов в различных географических зонах. Клинические изоляты обладают генами металло-бета-лактамазы и оксациллиназ, гидролизующих карбапенемы. У ряда из них экспериментально показана способность формировать плотную биопленку (таблица). В геноме штамма A. baumannii 60perm (MLST-тип 208-й пандемической линии II) присутствуют области, привнесенные пос- Идентификация, место выделения, фено- и генотипические данные Характеристика штамма G+C, мол.%, по данным WGS G+C, мол.%, в опероне pgaABCD pgaA pgaB pgaC 1 2 3 4 5 A. baumannii 60perm, клинический изолят (гемокультура), ОХА-66 и ОХА-72-позитивный, образует плотную биопленку (Пермь, Россия) 39,0 38,8 36,7 39,0 A. baumannii 1656-2, клинический изолят, теллуритR, PER-1, OXA-109-позитивный, образует плотную биопленку (Южная Корея) 39,2 38,8 36,7 39,0 A. baumannii 28, клинический изолят, ОХА-88-позитивный, ISCR2-позитивный (Санкт-Петербург, Россия) 38,9 39,2 37,0 39,1 A. baumannii MAR002, клинический изолят, способен к сверхпродукции биопленки (Испания) 39,1 39,3 36,9 38,9 Окончание таблицы 1 2 3 4 5 A. nosocomialis 6411 клинический изолят, NDM-1-позитивный (Колумбия) 38,8 39,2 36,7 38,1 A. pittii AP_882, клинический изолят, NDM-1 и ОХА-58-позитивный (Малайзия) 38,8 38,7 37,3 40,7 A. pittii (сalcoaceticus) PHEA-2, выделен из сточной воды промпредприятия, способен к росту на феноле (Китай) 38,8 38,7 37,4 40,7 A. oleivorans DR1, выделен из почвы рисового поля, способен к адгезии и росту на н-гекасдекане и дизельном топливе (Южная Корея) 38,7 39,0 37,3 40,9 E. coli O157:H7 Sakai, подгруппа EHEC патогенетической группы Shiga-toxigenic E. coli (Япония) 50,5 47,3 44,3 46,8 Примечание: WGS - полногеномное секвенирование. Данные по GC-составу для pgaD не приведены вследствие размера гена (всего 465 пар нуклеотидов). редством горизонтального переноса и обнаруживаемые также у штаммов азиатского происхождения (GenBank acc. no. AUZL00000000). Помимо ацинетобактеров использованы данные хорошо генетически характеризованного штамма E.coli O157:H7 Sakai, вызвавшего в 1996 г. вспышку инфекции среди 8000 школьников г. Сакаи, Япония [10]. Для выравнивания аминокислотных (транслированных) последовательностей применена программа Multiple Sequence Alignment (The European Bioinformatics Institute). Сравнительный анализ выполнен с привлечением ресурсов BLAST и BLASTClust, а также UniProt-KB/Swiss-Prot. Дендрограмма построена методом минимума эволюции (minimum-evolution method) с использованием программы MEGA, версия 6.0, показатель достоверности порядка ветвления определен на основании bootstrap-анализа, включавшего построение 1000 случайных деревьев. Результаты и их обсуждение Один из постулатов молекулярной генетики утверждает, что G+C-контент в ДНК не поддается существенному изменению в результате мутаций. У всех изученных представителей рода Acinetobacter процентное содержание G- и C- нуклеотидов в опероне биосинтеза PNAG практически соответствует характеристической видовой величине (таблица). В целом различия нуклеотидных последовательностей для генов, составляющих оперон pgaABCD внутри патогенетической группы Acinetobacter calcoaceticus-baumannii (в терминах идентичности, но не сходства), находятся в диапазоне 0-20 %, а различия между A. baumannii и A. oleivorans незначительно превышают 20 % (E-value 0.0). Картирование оперона на хромосоме штаммов A. baumannii 60perm и MAR002, «фланкирующих» по месту выделения территорию Европы, не выявило различий, он расположен между генами, кодирующими регулятор фосфоенолпируватсинтазы и флавопротеин (циклогексанон монооксигеназа, EC 1.14.13.22). Тогда как у штамма E.сoli O157:H7 отличие процентного содержания G- и C-нуклеотидов в опероне синтеза PNAG от характеристической видовой величины более выражено. Однако лишь различие ≥ 10 % между показателем геномного G+C, мол.% контента и мол.% в конкретном опероне может рассматриваться в числе убедительного доказательства факта горизонтального переноса [13], хотя некоторые амелиорации неродственного материала в структурированном геноме нового хозяина допускаются. Следует обратить внимание, что плазмида pO157 необходима штамму Sakai для синтеза плотной (тугой) биопленки, полезной, например, при колонизации поверхности пищевых продуктов [8]. Поэтому не исключено участие и иного мобильного генетического элемента в контроле процесса образования биопленки. Количество и распределение не- и синонимичных нуклеотидных замен в pgaABCD можно рассмотреть в качестве дискриминирующего признака для отдельных видов/штаммов. Все же особое внимание при поиске и анализе различий уделено первичной аминокислотной последовательности и более детально для pgaA, поскольку он рассматривается как «белок для синтеза биопленки» [12]. На рис. 1 представлены для сравнения позиции 511-800, поскольку методами рентгеноструктурного анализа и компьютерного молекулярного моделирования здесь для участка А-цепи построен 3D-образ (у E.coli). Видовой полиморфизм выражен в основном в виде замен сходных аминокислот. Однако выявлены и несходные замены, например, глутаминовой и аспарагиновой кислот на нейтральные неполярные глицин и аланин (позиции 529 и 682 на рис. 1 соответственно), полярной нейтральной аминокислоты аспарагин на полярный основной лизин (позиция 548), а также глицина на полярный основной аргинин (позиция 784). Замена «глицин-аргинин» не является единственной несходной, которая дискриминирует последовательность pgaA штамма MAR002, опубликованного как сверхпродуцент биопленки [6]. Так, показаны замены (в сравнении с A. baumannii 60perm) Ser → → Phe (нейтральная полярная на неполярную) и Asn → Ser (существенное различие в показателе гидрофобности). Таким образом оказалось, что полиморфизм аминокислотной последовательности pgaA можно использовать для дискриминации различных видов ацинетобактера, в частности отделить группу A. baumannii/A.nosocomialis от A. pittii (рис. 2). Такая дискриминация вызывает несомненный интерес, поскольку перечисленные виды традиционно включают в единый патогенетический комплекс A. сalcoaceticus - baumannii. Подобные различия выявляются при сравнении последовательности pgaBC (не приведены, включают замены неполярных нейтральных аминокислот на основные и кислотные и замены аминокислот, отличные по гидрофобности). У MAR002 в последовательности pgaB в сравнении с A. baumannii 60perm показаны пять несходных замен, в том числе Gly → Asp (неполярная нейтральная на кислотную) и His → Tyr (основная аминокислота на нейтральную). Известно, что замены несходных аминокислот находят выражение в пространственной структуре белка, определяющей активность продукта. Cледующим этапом исследования станет локализация вариабельных участков на 3D-моделях белков при использовании возможностей сервера I-TASSER [12]. Подобный образ, полученный методом in silico-симуляции, в 2016 г. опубликован для pgaC штамма A. junii SH20534 [12]. Аминокислотная последовательность pgaC здесь сильно дискриминирована от A. baumannii (в терминах идентичности и сходства), однако все консервативные аминокислоты, включая пять критически значимых (Asp140, Asp233, Gln269, Arg272 и Trp273), присутствуют на своих позициях [12]. Расширение исследуемой видовой выборки станет доступным в ближайшее время, поскольку «технология секвенирования ДНК становится рутинной операцией, более быстрой и более дешевой…» [1]. Применяя in silico-моделирование при анализе массива Рис. 1. Фрагмент аминокислотной (транслированной) последовательности pgaA в сравнении между видами/штаммами рода Acinetobacter. Примечание. PgaA (позиции 511-800): A. baumannii штаммы 60perm и 1656-2, GenBank acc. no. AUZL00000000 и CP001921 (1); A. baumannii штамм 28, GenBank acc. no. MAFT00000000 (2), A. baumannii штамм MAR002, GenBank acc. no. JRHB01000001 (3); A. nosocomialis штамм 6411, UniProt-KB acc. no. A0A0A7XJA0 (4); A. pittii штамм AP_882, GenBank acc. no. CP014477 (5); A. pittii (calcoaceticus) штамм PHEA-2, UniProt-KB acc. no. F0KHU1 (6); A. oleivorans штамм DR1, UniProt-KB acc. no. D8JGK8 (7); перспективный биоремедиатор A. oleivorans штамм PF-1, UniProt-KB acc. no. A0A0B2UD36 (8). Позиции замен сходных аминокислот [4] выделены двоеточием, несходных аминокислот - подчеркиванием Рис. 2. Дендрограмма, иллюстрирующая сходство аминокислотных (транслированнных) последовательностей pgaA (позиции 511-800). Обозначения штаммов соответствуют таковым на рис. 1 данных можно построить образ наиболее эффективно синтезирующей PNAG структуры. Также рассматривая способность к формированию плотной биопленки в числе факторов вирулентности, следует приступить к созданию модели «наиболее вирулентного» штамма. Подобное моделирование особенно ценно при изучении бактериальных таксонов, включающих как патогенные, так и непатогенные виды (Acinetobacter, Pseudomonas, Rhodococcus и т.п.). Выводы 1. Генетический ресурс в виде оперона биосинтеза PNAG, необходимого для образования биопленки, присутствует как у патогенных, так и непатогенных представителей рода Acinetobacter. Средствами in silico-анализа возможно дискриминировать группу A. baumannii/A.nosocomialis от перспективных для биоремедиации A. oleivorans. 2. Обнаруженные порядок генов, содержание G+C, мол.%, наличие несходных аминокислотных замен не подтверждают факт переноса оперона pgaABCD роду Acinetobacter от других патогенов. 3. Полиморфизм аминокислотных последовательностей (не только на уровне одиночных замен) играет, по-видимому, важную роль в механизме выживания ацинетобактера в виде биопленок, включая госпитальную внешнюю среду. В перспективе на основе in silico-моделей возможно будет отбирать и контролировать штаммы, способные к сверхпродукции полисахарида PNAG и биопленки.

About the authors

A P Solomenny

Email: solomen@iegm.ru

N A Zubareva

A E Goncharov

References

Supplementary files