Species diversity and biological properties of dominant species of causative agents of poststernotomic infectious complications in cardiac surgery

Full Text

Введение

Инфекционно-воспалительные осложнения (ИВО), развивающиеся после кардиохирургических вмешательств со стернальным доступом, такие как остеомиелит грудины и ребер, стерномедиастинит, являются тяжелыми жизнеугрожаемыми состояниями [1]. По оценкам различных исследователей они возникают в 0,3–9 % случаев [2, 3]. Вместе с тем с увеличением количества операций на открытом сердце их количество будет нарастать [4].

Известно, что этиологическими агентами ИВО, как с поверхностным, так и глубоким поражением тканей, может быть широкий спектр микроорганизмов – представителей различных таксономических групп [5–7]. Из грампозитивных бактерий это прежде всего бактерии рода Staphylococcus c доминированием S. aureus и S. epidermidis. На их долю приходится до 70–80 % всех ИВО у кардиохирургических пациентов [6]. Из других грамположительных микроорганизмов имеют значение бактерии родов Enterococcus spp. и Streptococcus spp., но эти микроорганизмы изолируют из стернальной раны существенно реже [5]. Среди грамнегативных бактерий превалируют представители семейства Enterobacteriaceae (Escherichia spp, Klebsiella spp., Enterobacter spp.), а также неферментирующие бактерии (Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp) [7, 8].

Анализируя вопросы этиологии ИВО, большинство клиницистов, как правило, ограничиваются лишь констатацией факта обнаружения тех или иных этиопатогенов, изучение их биологических свойств остается вне внимания исследователей. В то же время наличие определенных факторов вирулентности и персистенции у изолированных из области хирургического вмешательства микроорганизмов, их антибиотикочувствительности в значительной мере определяют тяжесть и особенности течения патологического процесса.

Цель исследования – изучение микробного состава и биологических свойств доминантных видов возбудителей инфекционно-воспалительных осложнений у кардиохирургических пациентов.

Материалы и методы исследования

Выполнено бактериологическое обследование 178 пациентов с различными клиническими формами ИВО, развившимися после кардиохирургических вмешательств со срединной стернотомией, в том числе 36 пациентов с диагнозом стерномедиастинита, 80 – остеомиелита грудины и ребер, 62 – нестабильности грудины. В качестве материала для исследования использовали отделяемое стернальной раны. Взятие, транспортировку и посев исследуемого материала проводили в соответствии с положениями приказа МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. Изолированные бактериальные культуры идентифицировали до вида на основании исследования морфологических, тинкториальных и биохимических свойств, используя соответствующие тест-системы (производства «ЭРБА-ЛАХЕМА», Чехия) «Стафи-», «Стрепто-», «Энтеро-», «Эн-Кокус-» и «Неферм-тесты 24». Для учета результатов применяли баканализатор фирмы ERMO-LABS STEM (Финляндия) и Multiskan-Ascent с компьютерной программой «Микроб-автомат», позволяющей проводить автоматическое считывание полученных данных. Наличие фактора вирулентности у выделенных из области хирургического вмешательства культур стафилококков и псевдомонад определяли традиционными методами. Для оценки факторов персистенции у штаммов стафилококков (антикомплементарной, антилизоцимной, антилактоферриновой активностей и способности к биопленкообразованию) использовали рекомендации О.В. Бухарина [9] и И.А. Шагинян с соавт. [10]. Биопленкообразование штаммов псевдомонад изучали по O. Toole et al. [11]. Чувствительность изолированных культур стафилококков и псевдомонад к антибактериальным препаратам изучали диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.12 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», утвержденными главным государственным санитарным врачом РФ. В качестве тестируемых использовали антибактериальные препараты основных групп, рекомендованным этим документом. Для стафилококков – беталактамы (оксицилин), аминогликозиды (гентамицин), линкозамиды (линкомицин), фторхинолоны (ципрофлоксацин), карбапенемы (имипенем) и ванкомицин. Штаммы псевдомонад тестировали в отношении цефалоспоринов третьего поколения (цефтазидим), карбапенемов (меропенем и имипенем), фторхинолонов (ципрофлоксацин, офлоксацин), аминогликозидов (гентамицин, амикоцин), полимиксинов (полимиксин В).

Статистический анализ полученных результатов выполняли с помощью компьютерной программы Statistica 6.0. Полученные количественные параметры приведены в виде средних арифметических величин и их ошибки (M ± m). Оценку достоверности различий сравниваемых показателей проводили, используя непараметрический критерий χ². Различия считали значимыми при p < 0,05. При анализе корреляционной связи полученных данных определяли коэффициент ранговой корреляции r по Спирмену.

Результаты и их обсуждение

Из области хирургического вмешательства у 96 % пациентов из 178 обследованных с ИВО были выделены микроорганизмы: всего из стернальной раны изолировано 242 штамма грамположительных и грамотрицательных бактерий, представителей различных таксонов, а также грибы рода Candida (табл. 1).

 

Таблица 1. Видовой спектр и частота выделения микроорганизмов из отделяемого стернальной раны

Микроорганизм	Количество выделенных штаммов
	абс.	%
S. aureus	73	30,17
S. epidermidis	51	21,07
S. saprophyticus	8	3,31
S. haemolyticus	7	2,89
S. warneri	7	2,89
S. hominis	5	2,067
Str. viridans	3	1,24
E. coli	23	9,50
K. pneumoniae	19	7,85
E. cloacae	2	0,83
C. freundii	1	0,41
P. aerugenosa	28	11,57
A. baumannii	1	0,41
Enterococcus faecium	8	3,31
Candida, spp	6	2,48
Всего	242	100

 

Как свидетельствуют данные, представленные в табл. 1, бактерии рода Staphylo coccus инфицировали область хирургического вмешательства существенно чаще. Их спектр характеризовался широким видовым разнообразием. Выделено шесть видов этих микроорганизмов. Доминировали S. aureus и S. epidermidis – 30,17 и 21,07 % соответственно от общего числа изолированных культур. О ведущей роли этих микроорганизмов в этиологии постстернотомических ИВО в кардиохирургии сообщают и другие исследователи [6]. Что касается грамотрицательных бактерий, то превалировали представители семейства Enterobacteriaceae – E. coli в 9,50 % и Klebsiella spp. в 7,85 % из общего количества выделенных культур. Следует отметить и достаточно высокую долю случаев контаминации стернальной раны штаммами P. aeruginosa – 11,75 %. Остальные виды микроорганизмов, в том числе грибы рода Candida spp., высевали из области хирургического вмешательства в единичных случаях. У 28 % обследованных пациентов из раневого отделяемого изолировали бактериальные ассоциации, как правило, они были представлены двумя сочленами, одним из которых являлись стафилококки.

Таким образом, при бактериологическом обследовании 178 пациентов с различными клиническим формами ИВО, возникшими после кардиохирургических вмешательств со стернальным доступом, более чем в половине случаев из области хирургического вмешательства были выделены культуры S. aureus и S. epidermidis. Из грамотрицательных бактерий чаще изолировали штаммы E. coli и P. aeruginosa. Анализируя результаты, следует подчеркнуть, что выделенные из стернальной раны при ИВО у кардиохирургических пациентов микроорганизмы, это, по существу, те же основные этиопатогены нозокомиальных инфекций различной локализации, регистрируемых в хирургических стационарах. Их принято обозначать аббревиатурой ЕСКАРЕ, что означает E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa и E. cloacae [12], причем их спектр последние 30 лет практически не меняется [13].

Принимая во внимание, что культуры S. aureus, S. epidermidis, а также P. aeruginosa являются доминантными этиопатогенами ИВО у обследованных пациентов, были изучены их основные биологические свойства, в частности, наличие и спектр факторов вирулентности, персистенции и антибиотикочувствительности именно у данных микроорганизмов.

Всего из области хирургического вмешательства был изолирован 151 штамм бактерий рода Staphylococcus, в том числе, 73 культуры S. aureus и 78 коагулазоотрицательных стафилококков (КОС), 51 из них – S. epidermidis. Результаты изучения факторов вирулентности и персистенции у них суммированы в табл. 2.

 

Таблица 2. Факторы вирулентности и персистенции бактерий рода Staphylococcus, выделенных из отделяемого стернальной раны

Микроорганизм	Количество штаммов, обладающих факторами, %
	вирулентности			персистенции
	Гемолизин	Лецитиназа	ДНК-аза	АЛА	АКА	АЛФА	БПО
S. aureus	100,0 ± 10,43	100,0 ± 10,43	94,40 ± 9,84	20,50 ± 2,14	100,0 ± 10,43	94,40 ± 9,84	94,40 ± 9,84
КОС	93,60 ± 9.76	19,1 ± 1,99	6,40 ± 0,67	81,00 ± 8,44	44,70 ± 4,66	97,90 ± 10,21	87,20 ± 9,84
Достоверность различий р	> 0,05	< 0,001	< 0,001	< 0,001	< 0,05	> 0,05	> 0,05

 

Примечание: АЛА – антилизоцимная активность; АКА – антикомплементарная активность; АЛФА – антилактоферриновая активность; БПО – биопленкообразование.

 

Из представленных данных следует, что штаммам S. aureus достоверно чаще, чем представителям КОС были присущи те или иные ферменты патогенности. Особенно значимы были эти различия в отношении лецитиназной и ДНК-азной активности. Практически все изоляты S. aureus, в отличие от штаммов КОС, обладали этими признаками. Иные закономерности констатировали при сравнительном анализе факторов персистенции у изучаемых культур. Независимо от видовой принадлежности, подавляющее большинство исследованных культур обладали определенным набором факторов персистенции. При этом частота встречаемости АЛФА и способности к биопленкообразованию (БПО) у штаммов сопоставляемых групп, по существу, была одинаково высокой. Однако культуры S. aureus статистически значимо чаще проявляли АКА в сравнении со штаммами КОС. Для последних, напротив, была более характерна АЛА.

Следовательно, колонизирующие область хирургического вмешательства у обследованных пациентов штаммы стафилококков различных видов могли противостоять действию гуморальных неспецифических факторов резистентности организма, таким как комплемент, лизоцим, лактоферрин и другим. Что касается способности к БПО, то образуемые микроорганизмами сообщества, защищенные матриксом, более устойчивы к воздействию антибактериальных препаратов, чем планктонные формы [14]. Наличие ферментов инвазии и агрессии у культур стафилококков, прежде всего S. aureus, изолированных из стернальной раны у пациентов с ИВО, и выраженные персистентные свойства подтверждают их этиологическую роль в развитии этих осложнений.

При изучении антибиотикочувствительности изолятов установлено, что все изученные культуры, как S. aureus, так и КОС, были чувствительны к ванкомицину, традиционно применяемому для лечения заболеваний, обусловленных полирезистентными штаммами бактерий рода Staphylococcus. В то же время практически половина штаммов S. aureus (42,8 %) и 21,42 % КОС были метициллинрезистентными (MRS). О росте этиологической значимости MRS-штаммов стафилококков при ИВО в кардиохирургии сообщают различные авторы, более того, по их мнению, обусловленные такими культурами заболевания отличаются тяжелым течением, а порой и негативным прогнозом [15]. Из других использованных антибиотиков имипенем и линкомицин характеризовались наибольшей эффективностью. Более 70 % штаммов S. aureus и подавляющее большинство КОС (90 %) проявляли чувствительность к имипенему и 64 и 70 % этих культур соответственно – к линкомицину. При этом изоляты стафилококков вне зависимости от вида отличались высокой резистентностью к гентамицину (S. aureus – 57,14 %; КОС – 35,71 %) и ципрофлоксацину практически в тех же пределах.

Таким образом, все культуры S. aureus, инфицировавшие область хирургического вмешательства у пациентов, находившихся под нашим наблюдением, характеризовались не только наличием широкого набора факторов вирулентности и персистенции, но и достаточно высокой резистентностью к ряду антибиотиков, в том числе метициллину. При этом в сравнении с представителями КОС они отличались большей вирулентностью и антибиотикоустойчивостью.

Как уже указывалось, среди грамотрицательных бактерий – этиопатогенов ИВО доминировали культуры P. aeruginosa. По наблюдениям ряда исследователей, их роль в этиологии ИВО различной локализации при кардиохирургических вмешательствах возрастает. Они могут быть причиной практически пятой части (до 17 %) всех случаев постстернотомических ИВО у кардиохирургических больных [16]. В результате бактериологического обследования 178 пациентов с такой патологией нами выделено 28 штаммов P. aeruginosa, что составило 11,57 % от общего числа изолированных микроорганизмов. Изучение их биологических свойств показало, что все 28 изолятов на жидкой питательной среде образовывали сине-зеленый пигмент. Его наличие является характерным видовым признаком этих микроорганизмов. Подавляющее большинство изученных культур (26) обладали гемолитической активностью. Степень ее выраженности варьировалась в широком диапазоне от 0,5 до 4,5 усл. ед., среднее значение составило 1,99 ± 0,53. Двадцати штаммам была присуща фосфолипазная активность, ее уровень также колебался в широких пределах – от 0,3 до 4,0 усл. ед. и в среднем был равен 2,04 ± 0,55. Как правило, эти ферменты вирулентности были характерны для одних и тех же культур. Между этими признаками констатировали прямую выраженную корреляцию: коэффициент корреляции r = 0,846, р = 0,0001. Более половины изученных штаммов (57,14 %) образовывали мукоид альгинат, входящий в состав экзополисахаридов. Такие бактерии, выделяя слизь, образуют на поверхности агара блестящие вязкие колонии. Подобная способность к слизеобразованию также является одним из факторов вирулентности культур P. aeruginosa.

БПО было характерно для всех 28 изученных штаммов, причем 64,28 % из них являлись высоко пленкообразующими вариантами. Степень выраженности этого феномена в среднем составила 0,903 ± 0,535 опт. ед. Между фосфолипазной, гемолитической активностями, с одной стороны, и уровнем продукции слизи, способностью к БПО – с другой, статически значимой зависимости не установлено.

Таким образом, культуры P. aeruginosa, изолированные от кардиохирургических пациентов с постстернотомическими ИВО, обладали не только теми или иными факторами вирулентности, но и персистенции. При этом большинству из них был присущ набор нескольких факторов вирулентности и выраженная способность к БПО.

В дальнейшем изучена чувствительность этих изолятов к антибиотикам. Все штаммы P. aeruginosa, выделенные из отделяемого стернальной раны, проявляли чувствительность к полимиксину В. Практически 70 % из них (69,80 %) ингибировались карбапенемами, а 67,64 % –цефтазидимом. Менее эффективными оказались амикоцин и гентамицин. Они были активны в отношении 57,46 и 52,72 % изученных штаммов соответственно. Более половины культур были резистентны к ципрофлоксацину (58,16 %) и офлоксацину (52,18 %). Четыре штамма P. aeruginosa характеризовались полирезистентностью, они были устойчивы к антибактериальным препаратам трех классов, в том числе и к карбапенемам. О росте уровня антибиотикорезистентности культур P. aeruginosa, циркулирующих в хирургических стационарах различного профиля, сообщают и другие исследователи [15]. Учитывая, что по существу все изученные нами штаммы P. aeruginosa образовывали биопленки, а более половины из них были высоко биопленкообразующими вариантами, можно полагать, что в условиях in vivo их чувствительность к антибиотикам будет значительно ниже. Сопоставляя полученные in vitro данные по эффективности протестированных препаратов, следует отметить, что карбапенемы обладали наибольшей антибактериальной активностью в отношении обоих доминантных видов (S. aureus и P. aeruginosa) – возбудителей ИВО у обследованных кардиохирургических пациентов.

Выводы

1. При бактериологическом обследовании 178 пациентов с инфекционно-воспали тельными осложнениями, развившимися после кардиохирургических вмешательств со стернальным доступом, из области хирургического вмешательства у 96 % из них выделены 252 штамма грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов – представителей различных таксономических групп.
2. Среди грамположительных бактерий доминировали aureus, на их долю пришлось 48,34 % от всех изолятов. P. aeruginosa преобладали среди грамнегативных бактерий – 11,60 % штаммов. Практически всем выделенным культурам этих видов был присущ определенный спектр факторов вирулентности и персистенции.
3. Более половины изолятов S. aureus были резистентны к фторхинолонам и аминогликозидам, а 42,8 % относились к метициллинрезистентным штаммам. Среди выделенных культур P. aeruginosa более 50 % были устойчивы к фторхинолонам. Наиболее эффективные препараты – карбапенемы: они подавляли рост 72 % штаммов S. aureus и 69,80 % P. aeruginosa.

About the authors

A. V. Kasatov

E.A. Vagner Perm State Medical University; Perm Regional Clinical Hospital

Email: eduard.gorovitz@mail.ru

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Head of Department of Hospital Surgery, Head Physician

Russian Federation

E. S. Gorovits

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: eduard.gorovitz@mail.ru

MD, PhD, Professor, Head of Department of Microbiology and Virology

Russian Federation

References

Supplementary files