DOSE-DEPENDENT EFFECT OF CADAVERINE ON HYDROXYL RADICALS’ PRODUCTION OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES

Full Text

Введение

В настоящее время наблюдается интерес к роли полиаминов в межклеточных коммуникациях, особенно в контексте микробных сообществ и развития воспаления [1], что обусловлено накопление этих соединений в очаге воспаления, а также их уникальной способностью влиять на клеточные процессы эукариотических клеток без участия специфических рецепторов [2, 3]. Известно, что такие полиамины, как кадаверин и путресцин воздействуют на экспрессию генов, активируют сигнальные каскады и модулируют интерклеточные сигналы, что делает их значимыми объектами для исследований [4, 5, 6]. Считается, что основными точками приложения полиаминов являются проникновение внутрь клетки через вторично-активный транспорт, изменение белковых молекул, связь с молекулами ДНК и РНК [5, 7]. Привлекает внимание среди семейства полиаминов кадаверин, который по своей химической структуре относится к алифатическим диаминам [6]. Показано, что различные факторы, включая недостаток питательных веществ, воздействие антимикробных и других веществ, присутствующих в очаге воспаления в значительном количестве, активизируют синтез кадаверина некоторыми микроорганизмами (Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Vibrio cholerae и др.) [8, 9, 10].

Как известно, образование активных форм кислорода лейкоцитами, таких как пероксид водорода, супероксидный анион-радикал, синглетный кислород, гидроксильный радикал и гипохлорид является ключевым фактором в процессе деструкции поглощенных объектов [11, 12]. Нарушение этого процесса приводит к незавершенности фагоцитоза и способствует в целом неэффективности всего клеточного звена иммунного ответа [13]. Ранее при исследовании полиаминов, было выявлено стимулирующее действие кадаверина на радикалпродуцирующую активность лейкоцитов [4, 14]. В настоящее время представляет интерес изучение дозозависимого эффекта этого полиамина.

Цель исследования – оценить изменение генерации гидроксильных радикалов лейкоцитами под влиянием кадаверина в концентрациях 1, 5 и 25 ммоль/л.

 

Материалы и методы исследования

Пробы периферической венозной крови были получены от 40 практически здоровых доноров. Для оценки продукции гидроксильных радикалов проводили реакцию люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) с лейкоцитами крови [15], выделенными методом седиментации с 0,1% метилцеллюлозой (США), с последующей инкубацией с кадаверином в концентрациях 1, 5 и 25 ммоль/л в течение 60 минут при 37оС. При постановке реакции ЛЗХЛ использовали 2×10–4M натриевой соли люминола (Sigma, США), предобработанные кадаверином клетки (25×106/мл). Измерение проводили на люминометре Luminoskan Ascent® Thermo Labsystems (США) в течение 180 мин. Для статистического анализа использовали интегральный показатель хемилюминисценции за весь период измерения (RLU). Рассчитывали время достижения максимума световспышек в минутах, интенсивность максимального свечения, а также площадь под кривой гашения люминесценции.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета Statistica 7.0. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. В случае распределения, приближенного к нормальному, использовали t-критерий Стьюдента, в остальных случаях - критерий Манна-Уитни для оценки значимости различий. За пороговый уровень значимости принимали величину p<0,05. Результаты представлены в виде среднего и его ошибки (M±m).

 

Результаты и их обсуждение

Установлено, что инкубация клеток с кадаверином существенно сокращает их время выхода на максимум генерации гидроксильных радикалов (рис. 1), которое составило 19,3±0,8 мин при концентрации кадаверина 1 ммоль/л (p=0,009 к пробам со спонтанной реакцией); 32,3±4,8 мин и 19,0±0,8 мин при 5 и 25 ммоль/л соответственно (p=0,09 и 0,02 к пробам со спонтанной реакцией). Максимальный интегральный показатель хемилюминисценции за весь период измерения при концентрации кадаверина 1 ммоль/л составил 0,081±0,004 RLU, при 5 ммоль/л - 0,130±0,013 RLU при 25 ммоль/л - 0,083±0,022 RLU (p=0,008; 0,009 и 0,004 к пробам со спонтанной реакцией). Как видно из рисунка 2 кадаверин статистически значимо усиливает интенсивность реакции ЛЗХЛ лейкоцитов здоровых доноров, при этом наибольший стимулирующий эффект зарегистрирован для концентрации полиамина 5 ммоль/л (p=0,009 к пробам со спонтанной реакцией, p=0,007 и 0,010 к пробам с кадаверином 1 ммоль/л и 25 ммоль/л соответственно). Аналогичный эффект выявлен и при расчете площади под кривой реакции ЛЗХЛ (рис. 3). Кадаверин увеличивает этот показатель, причем в концентрации 5 ммоль/л наиболее существенно - 20,89±3,00 у.е. против 0,86±0,07 у.е. при спонтанной реакции (p=0,001). Известно, что синтез бактериями полиаминов в очаге воспаления повышается. При этом постепенное накопление кадаверина, вероятно, оказывает стимулирующее влияние на генерацию радикалов лейкоцитами, что проявляется увеличением скорости их продукции, о чем говорит ускорение времени выхода на пик, а также накопление активных форм, о чем свидетельствует увеличение площади под кривой. Однако при дальнейшем увеличении концентрации полиаминов кадаверин выполняет роль «скавенджера» радикалов, снижая их содержание, что выражается в уменьшении площади под кривой в реакции ЛЗХЛ. Отмеченное в настоящем исследовании увеличение продукции радикалов, индуцированное предварительной обработкой кадаверином нейтрофилов и моноцитов, указывают на возможное влияние этого соединения на механизмы образования гидроксильных радикалов, а также активность диаминоксидазы в лейкоцитах [16]. Этот фермент катализирует превращение диаминов в аминоальдегид, что сопровождается высвобождением перекиси водорода с последующим взаимодействием с люминолом, присутствующим в реакционной смеси [13]. Стоит отметить, что активность диаминоксидазы возрастает практически мгновенно после инициации фагоцитарной активности [17, 18]. Известно, что диаминоксидаза выполняет антимедиаторные противовоспалительные функции путем инактивации гистамина и других диаминов, включая кадаверин и путресцин [19]. Это создает благоприятную среду для микроорганизмов, поскольку их структуры могут быть защищены избытком полиаминов, которые, в свою очередь, стимулируют антимедиаторную активность диаминоксидазы [20, 21]. В результате этого наблюдается снижение активности воспаления [7, 22], что также подтверждается исследованиями in vivo [23, 24].

Выводы

Таким образом, предыдущие исследования в поддержку гипотезы о полиаминах как рецептор-независимом факторе микробной агрессии [4] получили дополнительное подтверждение. Кадаверин, являющийся продуктом микроорганизмов, можно рассматривать как медиатор, опосредующий реализации персистентного потенциала бактерий путем гашения активности гидроксильного радикала.

About the authors

Ilya A. Morozov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: Lonny8@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4233-3711

Postgraduate student of the Department of Microbiology and Virology

Russian Federation

References

Supplementary files