Study of the influence of "Klyuchi" mineral water on the representatives of the indigenous intestinal microbiota

Full Text

Введение

Многолетний опыт применения минеральных вод (МВ) в медицинской практике свидетельствует, что они являются одним из основных наиболее действенных природных лечебных факторов. Неслучайно бальнеотерапия рассматривается как эффективный и безопасный вид санаторно-курортного лечения [1–3]. При этом МВ различных источников по своему составу (уровню минерализации, химическим компонентам и т.д.), а также механизму и степени выраженности терапевтического и бактериотропного действия существенно отличаются друг от друга [4–6].

В связи с тем что лечебно-столовые, питьевые МВ преимущественно используются для лечения заболеваний пищеварительной системы, изучение особенностей их влияния на жизнеспособность и функциональную активность облигатных таксонов микробиоты кишечного биотопа представляется необходимым для более полной и объективной оценки их терапевтического потенциала. Тем более, что дисбиотические нарушения в значительной степени определяют патогенез подобных заболеваний [7; 8].

МВ «КЛЮЧИ» классифицируется как маломинерализованная сульфатная магниево-кальциевая, слабощелочная питьевая лечебно-столовая вода, относящаяся по химическому составу в соответствии с ГОСТ Р 54316-2020 к минеральным водам XIII группы. Она рекомендована для лечения болезней органов пищеварения, эндокринной системы, расстройств питания и нарушений обмена веществ. В то же время ее влияние на представителей облигатной микробиоты кишечника остается неизученным, тогда как её терапевтический эффект, как и других МВ, возможно, связан с бактериотропным действием на микробиоценоз кишечника [9; 10].

Цель исследования – изучение бактериотропных свойств минеральной воды «КЛЮЧИ» в отношении бактерий родов Bifidobacterium, Lactobacillus и Escherichia.

Материалы и методы исследования

Исследовали МВ «КЛЮЧИ» из скважины № 1/92 ЗАО «Курорт Ключи». Образцы воды в стерильных флаконах хранили при температуре (4±2) °С не более 10 суток.

Тест-культурами служили пробиотические штаммы L. plantarum 8P-А3 и B. bifidum 1, используемые для получения лакто- и бифидосодержащих препаратов, а также генно-инженерный штамм E. coli lum+ со встроенным lux-опероном, отвечающий изменением уровня биолюминесценции в зависимости от физиологического состояния.

Лиофилизированные культуры (лактобактерин сухой и бифидумбактерин сухой производства НПО «Микроген») регидратировали 0,9 % стерильным раствором натрия хлорида (1-я серия опытов) и для контроля, а также минеральной водой (2-я серия опытов). Затем бактериальные культуры вносили в «голодную» углеводную питательную среду (0,5%-ный стерильный раствор глюкозы) L. plantarum до конечной концентрации в 1 мл 10⁸ КОЕ (колониеобразующих единиц) и B. bifidum до 10⁶ КОЕ/мл. К приготовленным бактериальным культурам в 1-й серии опытов добавляли 10 % (по объему) минеральной воды, в контроле и 2-й серии опытов – аналогичный объём физиологического раствора. Посевы лактобактериями инкубировали в термостате при температуре (37±2) °С в течение 22±2 ч, бифидобактерий – 44±4 ч.

Активность кислотообразования определяли методом кислотно-основного титрования 0,1М раствором натрия гидроксида до рН (8,5±0,1). Показатели рН оценивали потенциометрическим методом с помощью иономера универсального «И-160» (Россия). Кислотность выражали в градусах Тернера и вычисляли по формуле: °Т = А·К·10, где °Т – условная величина количества (мл) раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование 100 мл пробы; A – количество (мл) 0,1М раствора натрия гидроксида, использованного на титрование 10 мл пробы; К – поправка к титру раствора натрия гидроксида.

Рост бактериальных культур оценивали по изменению оптической плотности (мутности) в контрольной и опытных пробах на фотоэлектроколориметре «КФК-3» (Россия) в кювете с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм. Содержание глюкозы в пробах в начале и конце экспозиции определяли на автоматическом анализаторе глюкозы «Энзискан Ультра» (Россия).

Уровень стимуляции бактериальных культур выражали с помощью коэффициентов (КС). Рассчитывали отдельно КС роста (по показателям оптической плотности) и КС кислотообразования с использованием формулы:

$\mathrm{КС} =$$\raisebox{1ex}{${\mathrm{О}}_{\mathrm{кон}} – {\mathrm{О}}_{\mathrm{нач}} $}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{${\mathrm{К}}_{\mathrm{кон}} – {\mathrm{К}}_{\mathrm{нач}}$}\right.$,

где О_кон – средний конечный показатель в опытной пробе; О_нач – средний начальный показатель в опытной пробе; К_кон – средний конечный показатель в контрольной пробе; К_нач – средний начальный показатель в контрольной пробе.

Изучение культуральных свойств лакто- и бифидобактерий и биохимической активности штаммов проводили в условиях максимального ограничения доступа питательных веществ. Применение «голодной» питательной среды, лимитирующей потребности микробной популяции внутриклеточным запасом ранее накопленных нутриентов, позволило акцентированно выявить наличие стимулирующего или ингибирующего влияния исследуемой МВ на модельные штаммы. Такой методический подход более информативен и достоверен, чем культивирование на полноценной питательной среде.

Для оценки влияния МВ на физиологическое состояние индикаторного штамма E. coli lum+ использовали метод, основанный на хемилюминесцентной реакции. Данный тест связан с общим метаболизмом бактерий, влияющим на окисление восстановленного рибофлавин фосфата (FMH-H2) и длинноцепочечного жирного альдегида, излучающего свечение сине-зеленого цвета (490–495 нм) [11]. Для этого лиофилизированную культуру тест-штамма регидратировали следующими растворителями (по 5 мл на флакон): 0,9 % раствор натрия хлорида и вода питьевая (контроль), минеральная вода «КЛЮЧИ» (опыт). Исследуемые образцы инкубировали при комнатной температуре 24 ч, периодически регистрируя уровень свечения с помощью люминометра «Биотокс-6М».

Статистическую обработку полученных данных проводили в программе PAST 4.03. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Результаты в таблицах представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m).

Результаты и их обсуждение

Данные о влиянии МВ «КЛЮЧИ» на культуральные свойства лакто- и бифидобактерий представлены в табл. 1 и 2. Она оказывала выраженное стимулирующее действие на накопление биомассы и кислотообразование изучаемых штаммов.

 

Таблица 1. Влияние минеральной воды на накопление биомассы и функциональную активность лактобактерий, M±m

Серия эксперимента	Оптическая плотность, D			Кислотность, Тº			рН		Концентрация глюкозы, ммоль/л
	до	после	КС	до	после	КС	до	после	до	после
	инкубации			инкубации			инкубации		инкубации
Контроль	0,07±0,002	0,12±0,006	-	2,33±0,11	25,33±0,80		5,6±0,04	3,9±0,05	19,26±0,17	9,87±0,05
1 (добавление МВ в питательную среду)	0,08±0,001	0,14±0,002*	1,2	2,17±0,10	32,33±0,88*	1,31	5,5±0,05	3,8±0,03	19,36±0,13	8,42±0,03*
2 (регидратация МВ)	0,08±0,001	0,15±0,002*	1,4	2,20±0,10	31,66±0,72*	1,28	5,8±0,04	3,8±0,05	19,63±0,09	8,45±0,04*

Примечание: * p < 0,001 по t-критерию в сравнении с контролем; КС – коэффициент стимуляции; МВ – минеральная вода.

 

Таблица 2. Влияние минеральной воды на накопление биомассы и функциональную активность бифидобактерий, M±m

Серия эксперимента	Оптическая плотность, D			Кислотность, Тº			рН		Концентрация глюкозы, ммоль/л
	до	после	КС	до	после	КС	до	после	до	после
	инкубации			инкубации			инкубации		инкубации
Контроль	0,01±0,001	0,09±0,003	-	1,17±0,11	7,17±0,31		6,5±0,05	5,7±0,06	20,12±0,18	17,64±0,08
1 (добавление МВ в питательную среду)	0,01±0,001	0,21±0,005*	2,50	1,15±0,09	23,17±0,32*	3,67	6,7±0,07	3,8±0,01*	20,19±0,23	14,42±0,27*
2 (регидратация МВ)	0,01±0,001	0,22±0,004*	2,63	1,13±0,10	20,33±0,50*	3,20	6,8±0,02	3,8±0,02*	20,08±0,22	15,23±0,26*

Примечание: * p < 0,001 по t-критерию в сравнении с контролем; КС – коэффициент стимуляции; МВ – минеральная вода.

 

При культивировании бифидобактерий в 1-й и 2-й сериях опытов цифровые значения коэффициентов стимуляции роста, определяемые по приросту мутности бактериальной взвеси к окончанию сроков инкубации, были близки. В том и другом случаях регистрировали их значительное увеличение – в 2,5 и 2,63 раза.

У культур лактобактерий эти показатели были значительно ниже (увеличение в 1,2 и 1,4 раза), но также достаточными для оценки положительного эффекта влияния минеральной воды на накопление биомассы. При этом необходимо отметить, что на полноценных питательных средах уровень накопления биомассы этого штамма лактобактерий по величине КОЕ/мл может на два порядка превышать аналогичный показатель для испытуемого штамма бифидобактерий, поэтому данные отличия логичны. Важно подчеркнуть, что различные варианты контакта бактериальных клеток с МВ в виде растворителя лиофилизированой культуры или в качестве дополнительного компонента питательной среды обусловливали практически равнозначные положительные результаты.

При анализе биохимической активности бактериальных культур оказалось, что прирост кислотности лактобактерий в сериях опытов 1 и 2 в абсолютном выражении был более выражен (на уровне 30 °Т). Однако в относительных величинах КС у бифидобактерий был выше: 1,31 и 1,28 по сравнению с 3,67 и 3,12. В связи с этим следует отметить, что использованный штамм L. plantarum 8P-А3 является весьма активным продуцентом карбоновых кислот, поэтому более высокие значения этого показателя в абсолютных цифрах у лактобактерий и в опытах, и в контроле представляются закономерными.

Следствием выявленных эффектов стимулирования МВ «КЛЮЧИ» роста и активности кислотообразования бактериальных штаммов явилось более выраженное снижение в культуральной жидкости концентрации глюкозы в сериях опытов 1 и 2 по сравнению с контрольными данными. Рост тех и других культур был связан с более высоким абсолютным расходом глюкозы как в опытных, так и в контрольных пробах. Такие значения показателей обусловлены активным потреблением бактериями углеводного компонента, который необходим для обеспечения энергетических потребностей интенсивно развивающихся клеток.

При тестировании интенсивности биолюминесценции регистрировали изменение уровня свечения штамма E. coli lum+ после регидратации различными растворителями (вода питьевая, вода минеральная, физиологический раствор) в течение 24 ч экспозиции при температуре 22±2 °С. Во всех образцах, независимо от растворителя, наблюдали однородную кинетику интенсивности люминесценции, которая характеризовалась значительным повышением в течение начальной 2-часовой физиологической адаптации к регидратированному состоянию бактерий с последующим постепенным возвратом к исходному уровню в конце периода наблюдения. Интенсивность свечения культур регидратированных питьевой водой и физиологическим раствором (контроли) в период всей экспозиции отличалась незначительно. В то же время МВ оказывала выраженное стимулирующее действие, вызывая двукратное увеличение интенсивности свечения индикаторного штамма. Это убедительно свидетельствовало о благоприятном влиянии МВ «КЛЮЧИ» на физиологическое состояние данной культуры эшерихий.

Выводы

Выявленные выраженные стимулирующие эффекты действия МВ «КЛЮЧИ» на накопление биомассы, физиологическое состояние и функциональную активность клеток модельных представителей индигенной микробиоты кишечника подтверждают целесообразность и обоснованность её применения для лечения болезней органов пищеварения и метаболического синдрома, поскольку в их патогенезе существенную роль играют дисбиотические состояния микробиома человека. Наряду с этим, согласно современным представлениям, существует непосредственная связь между состоянием микробиоты кишечника и функцией различных органов и систем организма человека. Приводятся данные, свидетельствующие, что нарушения микробиоценоза кишечника способствуют развитию и поддержанию различных патологических состояний [12–14].

Полученные результаты позволяют рекомендовать использование МВ курорта «КЛЮЧИ» (Пермский край) в комплексном лечении различных заболеваний, и не только пищеварительной системы. Особенно целесообразно её применять на фоне пробиотикотерапии, в том числе как растворитель для лиофилизированных вариантов лекарственных форм соответствующих бактерийных препаратов.

About the authors

E. S. Gorovitz

Ye.A. Vagner Perm State Medical University

Email: lizavika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4320-8672

DSc (Medicine), Professor, Honored Scientist of the Russian Federation, Head of the Department of Microbiology and Virology

Russian Federation, Perm

V. A. Neschislyaev

Perm State Pharmaceutical Academy

Email: lizavika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8163-0674

DSc (Medicine), Professor of the Department of Industrial Technology of Drugs with a Course in Biotechnology

Russian Federation, Perm

E. V. Afanasevskaya

Ye.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: lizavika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3498-6459

PhD (Medicine), Associate Professor of the Department of Microbiology and Virology

Russian Federation, Perm

L. P. Chistokhina

Perm State Pharmaceutical Academy

Email: lizavika@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-9982-7211

PhD (Medicine), Researcher of the Department of Industrial Technology of Drugs with a Course in Biotechnology

Russian Federation, Perm

E. V. Orlova

Perm State Pharmaceutical Academy

Email: lizavika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0401-2546

DSc (Pharmacy), Head of the Department of Industrial Technology of Drugs with a Course in Biotechnology

Russian Federation, Perm

Yu. V. Sorokina

Perm State Pharmaceutical Academy

Email: lizavika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9114-7208

PhD (Pharmacy), Associate Professor of the Department of Industrial Technology of Drugs with a Course in Biotechnology

Russian Federation, Perm

A. M. Ivanov

"KLYUCHI" Resort

Email: lizavika@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-7352-8778

General Manager

Russian Federation, Klyuchi village, Perm region

A. R. Kolesova

"KLYUCHI" Resort

Email: lizavika@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-5484-2304

Deputy General Manager for Medical Work

Russian Federation, Klyuchi village, Perm region

References

Supplementary files