Quantitative determination of flavonoids in Lavatera Thuringiaca L., growing in Altai krai territory

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Хатьма тюрингенская (Lavatera thurin giaca L.) семейства Мальвовые (Malvaceae Juss.) – многолетнее травянистое растение, широко распространённое на территории Алтайского края. Комплекс биологически активных соединений (БАС) хатьмы тюрингенской травы отличается значительным структурным разнообразием и включает полисахариды, фенолокислоты, флавоноиды, конденсированные и гидролизуемые дубильные вещества, кумарины, что свидетельствует о целесообразности изучения и внедрения данного сырья в научную медицину [4–5]. Необходимо сравнить качественный состав и количественное содержание различных групп соединений в хатьмы тюрингенской траве.

Ранее нами были изучены спиртовое извлечение, эфирная, этилацетатная, бутанольная фракции хатьмы тюрингенской травы и обнаружены фенолокислоты, флавоноиды групп флавона, флавонола, катехина и другие соединения [5].

Целью данной работы является определение количественного содержания флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве, произрастающей в Алтайском крае.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила хатьмы тюрингенской трава, заготовленная в период бутонизации (июнь), цветения (июль) и плодоношения (август) в 2017 г. Заготовку проводили в семи районах Алтайского края, различающихся по климатическим условиям и уровню техногенной нагрузки: Бийский, Быстроистокский, Калманский, Красногорский, Солтонский, Целинный районы, окрестности города Барнаула.

На первоначальном этапе работы, используя воду очищенную и водно-спиртовые растворы различной концентрации, подбирали экстрагент, извлекающий максимальное количество флавоноидов хатьмы тюрингенской травы.

Количественное содержание суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве определяли методом дифференциальной спектрофотометрии по методике Государственной фармакопеи (ГФ) ΧӀӀӀ издания (ФС.2.5.0015.15) [1].

Оптическую плотность испытуемых растворов, растворов стандартного образца рутина («Sigma-Aldrich», каталожный номер R5143) измеряли на спектрофотометре «Schimadzu UV-mini 1240» при длине волны 410 нм, что соответствует максимуму поглощения комплексного соединения рутина с алюминия хлоридом.

Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье определяли в пересчёте на рутин. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с требованиями ГФ ΧӀӀӀ издания (ФС.1.1.0013.15) [1].

Валидацию методики количественного определения суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве проводили в соответствии с ОФС.1.1.0012.15. Оценивали такие параметры методики, как специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость) [1].

Для определения специфичности готовили спиртовое извлечение хатьмы тюрингенской травы и раствор стандартного образца рутина. Проводили реакцию комплексообразования с алюминия хлоридом. Полученные растворы исследовали методом дифференциальной спектрофотометрии. Сравнивали спектральные характеристики исследуемого и стандартного образцов.

Для определения линейности в мерные колбы вместимостью 25 мл помещали аликвоты спиртового извлечения хатьмы тюрингенской травы объёмом 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 мл, прибавляли по 2 мл спиртового раствора 2%-ного алюминия хлорида. Доводили объём раствора 96%-ным спиртом этиловым до метки, перемешивали. Далее поступали так, как описано в ФС.2.5.0015.15.

Экспериментальные данные обрабатывали методом наименьших квадратов. Составляли уравнение регрессии, рассчитывали коэффициент корреляции (r).

Для оценки правильности методики из спиртового извлечения хатьмы тюрингенской травы готовили разведения трёх уровней: 1 : 1; 1 : 1,5; 1 : 2. Определяли количественное содержание суммы флавоноидов в соответствии с валидируемой методикой. Рассчитывали открываемость (R, %) и относительное стандартное отклонение (RSD, %).

Повторяемость (сходимость) методики проверяли путём приготовления спиртовых извлечений хатьмы тюрингенской травы из 6 навесок сырья. Определяли количественное содержание суммы флавоноидов в исследуемых образцах в соответствии с тестируемой методикой. Определение проводили в одной лаборатории, в одинаковых условиях, в короткий промежуток времени.

Рассчитывали относительное стандартное отклонение (RSD, %).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе определения оптимального экстрагента для извлечения флавоноидов хатьмы тюрингенской травы использовали воду очищенную и водно-спиртовые смеси различной концентрации (от 30 до 90 %). Экстракцию проводили трижды по 30 мин, нагревая извлечения с обратным холодильником на кипящей водяной бане. Далее полученные извлечения исследовали методом дифференциальной спектрофотометрии. Выход флавоноидов в пересчёте на рутин при экстракции водой очищенной составил 0,59 %. При использовании в качестве экстрагента водно-спиртовых смесей в концентрации от 30 до 90 % установили, что при использовании спирта этилового 70%-ного выход флавоноидов составляет 1,02 % (рис. 1). Данный растворитель применяли для дальнейших исследований.

 

Рис. 1. Зависимость выхода флавоноидов хатьмы тюрингенской травы от концентрации спирта этилового

 

При проведении валидации методики количественного определения суммы флавоноидов хатьмы тюрингенской травы оценивали следующие показатели: специфичность, линейность, правильность, повторяемость.

В ходе определения специфичности снимали дифференциальные спектры продуктов реакции флавоноидов исследуемого сырья и стандартного образца рутина с алюминия хлоридом. Полученные спектры имеют максимумы поглощения при длине волны 410 нм. Другие группы фенольных соединений не дают характерных максимумов в данной области, что свидетельствует о достаточной специфичности методики [2].

Для оценки линейности готовили спиртовое извлечение хатьмы тюрингенской травы, как описано выше. Отбирали аликвоты извлечения объёмом 0,5; 0,75; 1,0; 1,25;  1,5 мл. Определяли количественное содержание суммы флавоноидов в полученных растворах в соответствии с валидируемой методикой.

Строили график зависимости оптической плотности растворов от количест венного содержания суммы флавоноидов (рис. 2).

Уравнение графика имеет следующий вид: y = 0,0932x + 0,0001. Значение коэффициента корреляции стремится к единице, что свидетельствует о наличии линейной зависимости оптической плотности от концентрации исследуемых растворов в пределах аналитической области методики.

Для оценки правильности методики из спиртового извлечения хатьмы тюрингенской травы готовили разведения, отбирая аликвоты объёмом 1,0; 1,5; 2,0 мл. На каждом уровне концентраций определяли количественное содержание суммы флавоноидов в трёх пробах в соответствии с валидируемой методикой (табл. 1).

Границы открываемости методики находятся в пределах 93,45–99,10 %, относительное стандартное отклонение составляет 1,88 %, что свидетельствует о высокой степени соответствия между значением расчётного и полученного содержания суммы флавоноидов в исследуемых образцах.

Оценку повторяемости (сходимости) проводили, измеряя оптическую плотность извлечений хатьмы тюрингенской травы, приготовленных из шести навесок, в соответствии с валидируемой методикой. Результаты представлены в табл. 2.

 

Рис. 2. График зависимости оптической плотности от содержания суммы флавоноидов в извлечении хатьмы тюрингенской травы

 

Таблица 1. Результаты оценки правильности методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве

№ п/п	Разведение  модельной смеси	Расчётное содержание суммы флавоноидов, %	Полученное содержание суммы флавоноидов, %	Открываемость, %	Метрологические  характеристики
1 2 3	1:1	1,12	1,08 1,10 1,07	96,43 98,21 95,54	= 97,24 %, s = 1,83, RSD = 1,88 %
1 2 3	1:1,5	1,68	1,57 1,66 1,64	93,45 98,80 97,62
1 2 3	1:2	2,24	2,21 2,22 2,18	98,66 99,10 97,32

 

Таблица 2. Результаты оценки сходимости методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве

Навеска, г	Оптическая  плотность	Содержание суммы флавоноидов  в пересчёте на рутин, %	Метрологические  характеристики
1,0028	0,1012	1,09	Р = 95 %, n = 6, f = 2,57, ± ∆ =1,12 ± 0,04 %, s = 0,02,  = 2,04 %, RSD = 1,79 % < 3 %
1,0036	0,1068	1,15
1,0043	0,1027	1,10
1,0016	0,1042	1,12
1,0031	0,1056	1,14
1,0012	0,1035	1,12

 

Из табл. 2 следует, что относительное стандартное отклонение результатов не превышает 3 %. Валидируемая методика удовлетворяет требованиям по сходимости.

Таким образом, методика количественного определения суммы флавоноидов хатьмы тюрингенской травы специфична, имеет линейный характер. Метрологические характеристики параметров, правильность и сходимость не превышают валидационные критерии. Методика пригодна для достижения цели исследования.

Общеизвестно, что содержание БАС зависит от срока заготовки сырья и места произрастания. Следующим этапом работы  являлось изучение динамики накопления флавоноидов в зависимости от фенологической фазы.

Максимальное количество флавоноидов отмечено в хатьмы тюрингенской траве в период бутонизации и цветения – 1,02–1,14 %, минимальное – в период плодоношения – 0,77 % (табл. 3). Данная закономерность согласуется с информацией о важной роли флавоноидов в процессах роста, развития и размножения растений, а также с рекомендациями по срокам заготовки морфологической группы сырья «Трава» [1–3].

Далее проводили определение содержания суммы флавоноидов в пересчёте на рутин в хатьмы тюрингенской траве, произрастающей в разных районах Алтайского края. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Выявлено, что содержание флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве, заготовленной

 

Таблица 3. Результаты количественного определения суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве

Экстрагент	Метрологические характеристики, Р = 95 %, n = 5, f = 2,78
	± ∆, %	s	, %
Вода очищенная	0,59 ± 0,05	0,03	5,36
Спирт этиловый 30%-ный	0,67 ± 0,05	0,03	4,82
Спирт этиловый 40%-ный	0,75 ± 0,06	0,03	4,67
Спирт этиловый 50%-ный	0,76 ± 0,07	0,04	5,66
Спирт этиловый 60%-ный	0,86 ± 0,05	0,03	3,53
Спирт этиловый 70%-ный	1,02 ± 0,07	0,04	3,88
Спирт этиловый 80%-ный	0,91 ± 0,06	0,03	3,83
Спирт этиловый 90%-ный	0,61 ± 0,05	0,03	4,96
Фенологическая фаза	Метрологические характеристики, Р = 95 %, n = 5, f = 2,78
	± ∆, %	s	, %
Бутонизации	1,14 ± 0,06	0,04	3,25
Цветения	1,02 ± 0,07	0,04	3,88
Плодоношения	0,77 ± 0,05	0,03	4,19
Район заготовки сырья	Метрологические характеристики, Р = 95 %, n = 5, f = 2,78
	±∆, %	s	, %
Бийский	1,02 ± 0,07	0,04	3,88
Быстроистокский	1,22 ± 0,07	0,04	3,50
Калманский	1,23 ± 0,07	0,04	3,28
Красногорский	1,06 ± 0,05	0,03	2,91
Солтонский	1,14 ± 0,05	0,03	2,54
Целинный	1,16 ± 0,05	0,03	2,81
Окрестности Барнаула	1,00 ± 0,04	0,02	2,08

 

в разных районах Алтайского края в период цветения, меняется незначительно и составляет 1,00–1,23 %.

Таким образом, можно рекомендовать сбор сырья в фазы бутонизации и цветения повсеместно на территории Алтайского края.

ВЫВОДЫ

1. В ходе работы установлено, что максимальное количество флавоноидов в пересчёте на рутин хатьмы тюрингенской травы извлекает спирт этиловый 70%-ный. Данный экстрагент следует использовать при определении количественного содержания суммы флавоноидов исследуемого сырья.
2. Проведена валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве  по показателям: специфичность, линейность, правильность, повторяемость. Доказано, что методика пригодна для исследования.
3. Методом дифференциальной спектрофотометрии установлено, что наибольшее накопление флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве происходит в фазы бутонизации (1,14 %) и цветения (1,02 %).
4. Сумма флавоноидов в пересчёте на рутин в хатьмы тюрингенской траве, заготовленной в различных местах произрастания, имеет сопоставимые значения и составляет 1,00–1,23 %, что свидетельствует о возможности заготовки сырья на территории разных районов Алтайского края.

About the authors

L. M. Fedoseeva

Altai State Medical University

Author for correspondence.
Email: olga_myznikova@mail.ru

доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармации

Russian Federation, 40, Lenina street, Barnaul, 656038

O. A. Myznikova

Altai State Medical University

Email: olga_myznikova@mail.ru

аспирант кафедры фармации

Russian Federation, 40, Lenina street, Barnaul, 656038

References

Supplementary files