Peculiarities of karyotype in patients with miscarriage

Full Text

Введение

Несмотря на достижения последних лет в области диагностики и профилактики невынашивания беременности (НБ), частота этой патологии сохраняется на прежнем уровне – 10–15 % от клинически диагностированных беременностей [1]. Дискутабельным остается вопрос об этиологической структуре НБ. По-видимому, это обусловлено многообразием причин, ведущих к прерыванию беременности, часто НБ является следствием не одной, а нескольких причин, действующих одновременно или последовательно. При обследовании супружеской пары с данной патологией требуется междисциплинарный подход с участием врачей различных специальностей: медицинского генетика, гематолога, эндокринолога, уролога-андролога, терапевта и др. В 50 % случаев после полного обследования супругов причины прерывания беременности остаются неизвестными («идиопатический выкидыш») [2].

В структуру НБ включают случаи самопроизвольных выкидышей и неразвивающиеся беременности. Отдельно выделяют понятие «привычное невынашивание беременности» (ПНБ). Согласно российским клиническим рекомендациям, в настоящее время ПНБ диагностируют при трех и более спонтанных прерываний беременности в сроке до 22 недель [3]. Международные гайдлайны ESHRE (European society of human reproduction and embryology, Европейское общество репродукции человека и эмбриологии), ASRM (American society for reproductive medicine, Американское общество репродуктивной медицины) и российские клинические рекомендации «Вспомогательные репродуктивные технологии и искусственная инсеминация» определяют данное состояние как два самопроизвольных прерывания беременности и более [2–5]. Предполагают, что ПНБ регистрируют у 1–3 % супружеских пар [6].

Одной из ведущих причин НБ на ранних сроках принято считать генетический фактор. НБ является мультифакториальным осложнением беременности: результат действия «функционально ослабленных» вариантов (аллелей) множества генов на фоне неблагоприятных внешних и внутренних факторов [7]. В мире в настоящее время изучен аллельный полиморфизм более 40 генов, относящихся к генной сети НБ. Согласно современным представлениям, проблему НБ нельзя решать только во время беременности. Для выяснения причин выкидышей, а также для оценки состояния репродуктивной системы супругов необходимо комплексное обследование (женщин и мужчин) вне беременности. Особую важность приобретают разработки новых диагностических и профилактических подходов, направленных на раннее, досимптоматическое выявление супружеских пар высокого риска по НБ [8].

Хромосомные структурные перестройки у родителей как причина прерываний беременности выявляются в 1,5 % случаев, и при рецидиве выкидыша этот показатель выше [9]. У 2–5 % супружеских пар с ПНБ при кариотипировании выявляют структурные перестройки хромосом, что значительно выше по сравнению с общей популяцией (0,3 %) [10]. Чаще всего встречаются транслокации, инверсии и инсерции [2]. Например, наличие сбалансированной транслокации у одного из родителей может привести к возникновению несбалансированной транслокации у плода, и последующий фенотип зависит от наличия специфических удвоений или отсутствия сегментов хромосом. При этом у фенотипически нормальных родителей возможно рождение детей или спонтанное прерывание беременности, при этом плод имеет патологические изменения в виде удвоения хромосомы или отсутствия участка в результате нормальной сегрегации в процессе мейоза [11]. Частота сбалансированных транслокаций у женщин выше, чем у мужчин. И чаще встречается в семьях с мертворождением в анамнезе или у детей с аномалиями, рожденных живыми [12].

Международные клинические рекомендации ассоциаций акушеров-гинекологов и репродуктологов по вопросам проведения генетических исследований супружеской пары при ПНБ значительно различаются. Американское общество репродуктивной медицины (ASRM – American Society for Reproductive Medicine) рекомендует кариотипирование супружеской пары, но не генетическое тестирование плодного материала [2]. Согласно протоколам Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE – European Society of Human Reproduction and Embryology) не показано рутинное кариотипирование и генетическое исследование плодного материла, а только после оценки индивидуальных рисков [4]. По данным Королевского колледжа акушеров-гинекологов (RCOG – Royal College of Obstetricians and Gynaecologists), кариотипирование супругов проводится в случае выявления несбалансированной хромосомной аномалии плода, генетическое исследование абортуса проводится при третьем и последующих выкидышах [13]. Другие ученые рекомендуют кариотипирование пары с ПНБ, и при выявлении генетических аномалий у будущих родителей или у эмбриона показана консультация генетика для оценки шансов рождения здорового ребенка [14].

Цель исследования – изучение особенностей кариотипа пациенток с невынашиванием беременности.

Материалы и методы исследования

Проведено цитогенетическое исследование крови пациенток с НБ, которое включало в себя анализ числа и морфологической структуры хромосом стандартным цитогенетическим методом – кариотипированием [13]. Для кариотипирования использовали препараты хромосом, полученные стандартной методикой стимулирования лимфоцитов периферической крови фитогемагглютинином с последующей фиксацией клеток в стадии метафазы и G-окрашиванием. При метафазном анализе учитывали не менее 11 метафазных пластинок. Визуализацию препаратов осуществляли микроскопированием при увеличении 1125, с использованием системы «Видео-Тест-Карио», версия 3.0. Заключение о кариотипе составляли в соответствии с правилами Международной номенклатуры хромосом ISCN – 2005 [11].

Также у респондентов оценивали уровень цинка (Zn) в плазме крови на автоматизированном электрохемилюминесцентном лабораторном комплексе «Элексис 2010» («Хоффманн-Ла Рош Лтд.»). Согласно рекомендациям производителя, референсный уровень Zn в плазме крови составляет 10,4–16,4 мкмоль/л.

Проведена сравнительная оценка кариотипов женщин, беременность которых протекала без осложнений и закончилась рождением здорового ребенка (75 человек, I группа) и пациенток с НБ (135 человек, II группа), из них IIa группу составили 68 женщин с первой беременностью, закончившейся самопроизвольным прерыванием в I триместре, IIb группу – 67 с первой и последующей беременностью, прервавшейся в I триместре (ПНБ). Набор материала проведен в период с 2014 по 2020 г. Группы были сопоставимы по возрасту (29,9 ± 0,2 и 31,4 ± 0,4 соответственно в I и II группах).

Статистическая обработка полученного материала проводилась в программе Exel, а также с помощью программы StatTech v.2.1.0 (ООО «Статтех», Россия, 2020. Регистрационное удостоверение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, № 2020615715 от 29.05.2020). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро – Уилка. В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3). При оценке статистической достоверности различий (р) в условиях отсутствия нормального распределения применялись U-критерий Манна – Уитни (U) и хи-квадрат (χ2). Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

Достоверно большее (χ2 = 14,908, р = 0,000049) число пациенток с нормальным кариотипом (46, ХХ) было в I группе – 72 (98,1 %). Результаты анализа показали преобладание кариотипов с полиморфными изменениями хромосом во II группе (χ2 = 35,472, р < 0,001): I группа – 3 пациентки (2,2 %), II группа – 34 (25,2 %), т.е. вероятность НБ у пациенток с полиморфизмами хромосом в 8 раз выше, чем у женщин с нормальным кариотипом (ОШ = 8,079; 95 % ДИ = 2,389–27,327). Варианты полиморфизма по одной и двум хромосомам представлены в табл. 1.

Данные о структуре полиморфизма хромосом (табл. 2) показывают, что во II группе изменения одной хромосомы встречаются у 8,8 % (3 женщины), двух хромосом – у 23,5 % (8). При этом среди акроцентрических хромосом полиморфизм чаще встречается в 14-й паре (40 %), а полиморфизм гетерохроматиновых сегментов – в 1-й паре хромосом (52,9 %).

Анализ данных II группы показал достоверные различия в подгруппах по частоте встречаемости полиморфизма хромосом (χ2 = 28,405, р < 0,001): у пациенток IIа группы отмечены изменения только в одной хромосоме, а в IIв – у каждой пятой женщины выявлен полиморфизм двух хромосом. В обеих подгруппах среди изменений в одной хромосоме преобладали полиморфизмы 14-й пары (66,6 и 42,1 % во IIa и IIb подгруппах соответственно). Также выявлены отличия по частоте полиморфизмов в гетерохроматиновых сегментах хромосом, изменения встречались у значительно большего числа пациенток с ПНБ (χ2 = 8,761; р = 0,004). Следует отметить, что в данной группе выявлен полиморфизм в 1-й, 9-й и 16-й парах хромосом, в то время как во IIа – только в 1-й паре.

При сравнении полиморфизма акроцентричных хромосом отмечено преобладание данного варианта у пациенток IIа группы в 22-й хромосоме (38,1 %) и IIв – в 14-й хромосоме (42,1 %).

 

Таблица 1

Варианты полиморфизма

Варианты полиморфизма одной хромосомы	Варианты полиморфизма двух хромосом
Увеличение размеров спутников 13 хромосомы	Увеличение размеров спутников 13 и 22 хромосомы
Увеличение размеров спутников 14 хромосомы	Увеличение размеров спутников 13 и 21 хромосомы
Увеличение размеров спутников 15 хромосомы	Увеличение размеров спутников 14 и 21 хромосомы
Увеличение размеров спутников 21 хромосомы	Увеличение размеров спутников 14 и 22 хромосомы
Увеличение размеров спутников 22 хромосомы	–
Двойные спутники 14 хромосомы	–
Увеличение размеров гетерохроматинового сегмента 1 хромосомы	–
Увеличение размеров гетерохроматинового сегмента 9 хромосомы	–
Увеличение размеров гетерохроматинового сегмента 16 хромосомы	–

 

Таблица 2

Кариотипы с вариантами нормального полиморфизма хромосом, абс.

Показатель		Полиморфизм акроцентрических хромосом						Полиморфизм гетерохроматиновых сегментов хромосом			Полиморфизм двух хромосом				Всего
		46,XX, 13ps+	46,XX, 14ps+	46,XX, 15ps+	46,XX, 21ps+	46,XX, 22ps+	46,XX, 14pss	46,XX,1qh+	46,XX,9qh+	46,XX,16qh+	46,XХ,13ps+,21ps+	46,XХ,13ps+,22ps+	46,XХ,14ps+,21ps+	46,XХ,14ps+,22ps+
Группа I, n = 75		0	0	0	0	1	2	0	0	0	0	0	0	0	3
Группа II	Всего, n = 135	3	2	3	2	2	4	3	2	2	3	4	1	3	34
	IIа, n = 68	1	1	1	2	1	1	1	0	0	1	1	0	1	11
	IIв, n = 67	2	1	2	0	1	3	2	2	2	2	3	1	2	23

 

Несмотря на то что роль полиморфизма хромосом и генных мутаций в настоящее время имеет достаточно высокий уровень разработанности, мировое научное сообщество продолжает изучение этой темы в аспекте поиска внешних факторов, которые могут влиять на формирование генетического аппарата внутриутробно. Данные факторы рассматриваются как управляемые, т.е. при их нивелировании, как предполагается, можно минимизировать вероятность хромосомных аберраций. В частности, рассматриваются такие механизмы воздействия, как влияние радиации, вирусных инфекционных заболеваний и особенности питания матери во время беременности [15]. Зарубежные коллеги подчеркивают актуальность изучения рациона будущей матери, так как этот фактор наиболее доступен для коррекции. Вместе с этим литературные данные о влиянии питания матери во время беременности на генетический материал плода весьма немногочисленны.

Поддерживая эту идею, мы предположили, что, возможно, существует взаимосвязь между дефицитом цинка (Zn) у матери и развитием полиморфизмов хромосом плода, так как в некоторых литературных источниках есть указания на связь дефицита Zn с хромосомными аномалиями [16]. Zn является эссенциальным компонентом более 200 металлопротеинов, в том числе ДНК-полимеразы (ДНК-полимераза-Zn-зависимый фермент), которая участвует в регуляции дифференцировки, пролиферации клеток и образовании хромосомных транслокаций. Zn стабилизирует структуру ДНК и РНК, он необходим для активации РНК-полимераз (в делении клеток), а также участвует (в составе белков хроматина) в процессах транскрипции и репликации. R.F. Muller et al. [15] указывают, что существуют так называемые, домены «цинковых пальцев» – ДНК-связывающие участки белков, в поддержании структуры которых участвует ион цинка. Вероятно, нарушение структуры такого домена может оказаться губительным для клетки. Дефицит Zn приводит к изменению структуры ДНК-полимеразы и изменению количества данного фермента, что, в свою очередь, ведет к появлению хромосомных аномалий. Данный вывод основывается на доказанном влиянии Zn на репликацию ДНК, которая осуществляется с помощью ДНК-полимеразы, и именно Zn, являясь активным центром, обеспечивает взаимодействие ДНК-полимеразы с той последовательностью нуклеотидов, с которой будет переписываться информация. В результате образуются две цепочки ДНК, заканчивается деление клетки.

Целью данного исследования не стояло изучение особенностей кариотипа абортусов, однако, учитывая, что полиморфизмы могут наследоваться [13], высказано предположение, что, возможно, дефицит Zn матери во время беременности будет увеличивать риск реализации осложнений у плода при совокупности этих факторов.

Проведен сравнительный анализ уровня Zn у пациенток с различным строением хромосом. Медиана уровня Zn в I группе составилa 10,3 мкмоль/мл, при этом у пациенток с нормальным кариотипом показатель составил 10,4 мкмоль/мл, а у пациенток с наличием полиморфизмов выявлен дефицит Zn (Me = 6,9 мкмоль/мл (5,7–9,6). Во II группе: Ме = 9,3 мкмоль/мл (7,1–12,9), при полиморфизме строения хромосом Ме = 8,3 мкмоль/мл (6,2–11,8), уровень значимости р < 0,05. Кроме того, получены интересные данные при сравнении пациенток с изменениями в одной и двух хромосомах. Me уровня Zn при наличии изменений в одной хромосоме составила 9,0 мкмоль/мл (7,9–11,4), двух хромосомах Ме = 7,0 мкмоль/мл (5,5–9,1), уровень значимости р < 0,05. Полагаем, что полученные данные могут представлять научный интерес и требуют дальнейшего изучения в аспекте поиска возможных механизмов влияния дефицита потребления Zn матерью в комплексе факторов, увеличивающих вероятность формирования хромосомных аномалий плода.

Анализ результатов кариотипирования показал, что у 24,5 % пациенток с однократной потерей беременности встречаются кариотипы с полиморфизмом хромосом, при этом у пациенток с ПНБ их доля значительно выше и составляет 40,1 %. Установленный полиморфизм наиболее характерен для акроцентрических хромосом, отражает наличие и величину спутников в области коротких плеч хромосом. В метацентрических и субметацентрических хромосомах наблюдается вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов. У пациенток с ПНБ достоверно выше число полиморфизмов, в том числе больше число полиморфизмов в двух хромосомах у одного индивидуума.

Вопрос влияния полиморфизма строения хромосом остается дискутабельным, результаты нашего исследования свидетельствуют о возможном влиянии описанных изменений хромосом на течение беременности. Данный вывод подтверждается увеличением шанса развития ПНБ у пациенток с полиморфизмом строения хромосом в 13,1 (OШ = 13,143; ДИ 95 % = 7,803-37,430). Показатель NNT (число больных, которых необходимо лечить), равный 4,4, свидетельствует, что у каждой из четырех женщин, имеющих полиморфизм строения хромосом, по крайней мере одна будет иметь такое осложнение, как НБ [17, 18].

Выводы

1. Различие частот полиморфизмов хромосом при спорадическом невынашивании и ПНБ статистически значимо, поэтому можно говорить, что наличие полиморфизма влияет на частоту ПНБ в популяции (вероятность ошибки p < 0,05). Расчет отношения шансов показал, что наличие изменений в структуре хромосом, которые считаются нормой, увеличивает риск НБ в 3 раза (OШ = 3,016; ДИ 95 % = 2,044–4,451), а шанс ПНБ повышается в 4,4 раза.
2. Выявлена связь между дефицитом Zn и полиморфизмом строения хромосом матери. На основании расчета отношения шансов показано, что у пациенток с дефицитом Zn шанс развития изменений в структуре хромосом в 21,1 раза выше, по сравнению с женщинами с нормальным уровнем Zn. Данный факт объясняется тем, что Zn входит в состав фермента ДНК-полимеразы, при его дефиците нарушается функция фермента и возрастает риск развития нарушений в структуре хромосом.
3. Генетические поломки относятся к неуправляемым факторам и напрямую воздействовать на них не представляется возможным, перспективным является поиск возможных механизмов, приводящих к ним. Важным аспектом является научный поиск управляемых причин нарушений фертильности как меры сохранения репродуктивного потенциала.

About the authors

A. A. Olina

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: gulnara-sadykova@mail.ru

MD, PhD, Professor, Department of Obstetrics and Gynecology №1

Russian Federation, Perm

G. K. Sadykova

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: gulnara-sadykova@mail.ru

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Obstetrics and Gynecology №1

Russian Federation, Perm

E. V. Shirinkina

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: gulnara-sadykova@mail.ru

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Obstetrics and Gynecology №1

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files