ERYTHROPOIESIS IN ERYTHROBLASTIC BONE MARROW ISLETS DURING TOXIGENIC PERIOD AFTER EXPOSURE TO DIFFERENT POLYCHLORINATED BIPHENYLS DOSES

Full Text

Введение В последние несколько десятилетий уделяется повышенное внимание группе стойких органических загрязнителей, которые воздействуют на среду обитания человека и животных при чрезвычайно низких концентрациях. Среди стойких органических загрязнителей полихлорированные бифенилы (ПХБ) являются одними из самых распространенных. Характер и динамика распределения ПХБ в окружающей среде во многом определяются их физическими свойствами, такими как химическая инертность, достаточно высокая плотность паров и способность сорбироваться на частицах. Несмотря на постепенное сокращение применения ПХБ в хозяйственной деятельности, они продолжают загрязнять окружающую среду, и в настоящее время эти токсичные продукты, распространившиеся по всему миру, присутствуют в организме каждого из жителей планеты. По мере включения ПХБ в биологические пищевые цепи происходит прогрессивная потеря низкохлорированных компонентов и накопление опасных высокохлорированных ПХБ в организмах человека и животных [9]. Для человека ПХБ является потенциальным фактором риска развития бесплодия, спонтанных абортов, мертворождений, врожденных пороков развития; выявлены их тератогенный и эмбриотоксический эффекты [10]. Экспериментальными исследованиями установлено, что под воздействием ПХБ в системе крови отмечаются лейкопения, гемолитическая анемия с явлением дизэритропоэза в костном мозге [1, 5]. Токсическое действие ПХБ в основном рассматривалось на примере острых и подострых интоксикаций у экспериментальных животных, в то же время в доступной литературе нет данных об изменениях в системе крови в течение длительного периода после прекращения поступления ПХБ в организм человека и животных. Цель настоящего исследования - анализ изменений в токсигенном периоде после введения различных доз ПХБ в эритробластических островках (ЭО) костного мозга, включая изучение характера волн амплификации эритробластов и реконструкции эритропоэза. Материалы и методы исследования Исследования выполнены на 135 белых беспородных крысах (самцах) весом 170-240 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария, в клетках по 15 особей, при нормальном уровне освещённости, находились на традиционном пищевом рационе, вода не ограничивалась. Эвтаназию животных путём дислокации шейных позвонков проводили под эфирным наркозом в отдельном от вивария помещении. Для исследования эритропоэза производился забор костного мозга. Модель подострой интоксикации ПХБ создавали путем введения крысам коммерческой смеси «Совол» в объеме 1 мл ежедневно в течение 28 дней с помощью зонда внутрижелудочно. В зависимости от вводимой дозы препарата животные подразделялись на две группы: I группа (n = 45) - суммарная доза ПХБ за все сроки его введения составила 3000 мг/кг, что соответствует токсическому действию препарата при 1/2 ЛД50; II группа (n = 45) - суммарная доза ПХБ за все сроки его введения составила 150 мг/кг, что соответствует токсическому действию препарата при 1/40 ЛД50. Контрольной группе животных (n = 45) вводили по 1 мл растительного масла также в течение 28 дней. Забор экспериментального материала от каждой группы животных, включая контрольную, осуществляли на 7-е, 28-е, 56-е сутки после завершения периода подострой интоксикации ПХБ (28 суток). Для оценки состояния кроветворения в центральном звене эритрона проводили подсчет абсолютного количества и распределение ЭО костного мозга бедренных костей по классам зрелости по методу Ю.М. Захарова, И.Ю. Мельникова, А.Г. Рассохина (1984-1990 г.). Качественная характеристика ЭО основана на их подразделении по классу зрелости и учитывает темп пролиферации и созревания эритроидных клеток в костном мозге вплоть до ретикулоцитов, а также способность повторного вовлечения макрофагов ЭО в эритропоэз. Согласно этим принципам выделяют следующие классы ЭО [2]: ЭО1 (1-го класса зрелости) - клетки ЭО представлены проэритробластами, эритробластами, базофильными нормобластами; число эритроидных клеток, способных к делению, менее или равно 8. ЭО2 (2-го класса зрелости) - клетки ЭО представлены базофильными и полихроматофильными нормобластами; число ядросодержащих клеток, способных к делению, от 9 до 16. ЭО3 (3-го класса зрелости) - клетки ЭО представлены полихроматофильными и оксифильными нормобластами, а также ретикулоцитами; число ядросодержащих клеток, способных к делению, более 16. ЭОинв (ЭО инволюцирующие) представлены полихроматофильными, оксифильными нормобластами и ретикулоцитами; число ядросодержащих клеток, не способных к делению, менее 16. ЭОрек (ЭО реконструирующие) - присоединение к инволюцирующему ЭО эритроидных клеток, способных к делению, т.е. появление в ЭО наряду с полихроматофильными, оксифильными нормобластами и ретикулоцитами проэритробластов и/или базофильных нормобластов. Важным доказательством реконструкции эритропоэза в ЭО является амплификация эритроидных клеток, происходящих из новой эритроидной колониеобразующей клетки, т.е. в реконструирующемся островке должны быть признаки удвоения проэритробластов, эритробластов, а также базофильных нормобластов. Изучение морфологии ЭО, определение степени зрелости островков проводили при увеличении микроскопа × 900 с масляной иммерсией. На основании данных вышеуказанной методики рассчитывали функциональные показатели эритропоэза в ЭО по методу Л.В. Ворговой и Ю.М. Захарова (1990 г.): общее количество колониеобразующих эритроидных клеток (КОЕэ), вступивших в эритроидную дифференцировку в ЭО; показатель вовлечения КОЕэ в дифференцировку проэритробласта в ЭО; показатель длительности созревания и повторного вовлечения макрофагов ЭО в эритропоэз. Результаты и их обсуждение Известно, что в исследованном нами экспериментальном временном диапазоне, включая период введения препарата (28 суток) и токсигенный период (2 месяца), у группы контрольных крыс мало изменялся количественный и качественный состав ЭО. В связи с этим нами не была использована группа динамического контроля. Содержание абсолютного количества ЭО костного мозга к концу подострого периода (28-е сутки) во всех экспериментальных группах было ниже, чем в контрольной группе (рис. 1), составив (120,0 ± 3,87)× ×103/бедро (р < 0,05) в группе 1/2 ЛД50 и (228,9 ± 12,37)103/бедро (р > 0,05) в группе 1/40 ЛД50, при контроле - (235,0 ± 0,98) × ×103/бедро. В группе 1/2 ЛД50 на 7-е сутки количество ЭО оставалось повышенным (246,7 ± 77,53)103/бедро (р > 0,05) при срав-нении с контролем. К 28-м суткам их количество составило (215,6 ± 80,7)103/бедро (р > 0,05) и в последующие сроки до конца эксперимента (56-е сутки) было примерно на том же уровне. 11.tif Рис. 1. Содержание абсолютного количества ЭО (×103/бедро) костного мозга крыс в токсигенном периоде после подострого воздействия различных доз ПХБ В группе животных с 1/40 ЛД50 абсолютное количество ЭО костного мозга с 7-х суток ((296,6 ± 14,53)103/бедро; р < 0,05, р1 < 0,05; рис. 1) постепенно понизилось в течение 3 недель, достигнув минимальных значений к 28-м суткам опыта, составив (47,8 ± 14,7)103/бедро (р < 0,05, р1 < 0,05). В дальнейшем, до конца эксперимента (56-е сутки), количество ЭО существенно не изменялось, что не превышало результаты, полученные к 28-м суткам подострого периода (228,9 ± 12,37)103/бедро, (р > 0,05) и контрольные значения ((235,0 ± ± 0,98)103/бедро). Таким образом, анализ абсолютного количества ЭО показал, что различные дозы экотоксиканта ведут к развитию неоднотипных ответных реакций в центральном звене эритрона. Функциональные показатели эритропоэза и распределение ЭО по классам зрелости у экспериментальных животных представлены на рис. 2, а, б и в таблице. После окончания введения ПХБ в дозе 1/2 ЛД50 на 7-е сутки произошло увеличение количества пролиферирующих классов ЭО (ЭО1, ЭО2) с одновременным снижением ЭОинв, что свидетельствует об активации эритропоэза за счет пролиферативных процессов в костном мозге. Усиление процессов новообразования эритроцитов обеспечивается возрастанием вовлечения КОЕэ в дифференциацию по сравнению с 28-ми сутками подострого периода. Причем вовлечение КОЕэ в дифференциацию произошло преимущественно за счет повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз (показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз в данной группе на 7-е сутки в 4,1 раза был выше контроля). Увеличение количества ЭО2 в этот период (в 8,6 раза выше контроля) отражает нарастание амплификации эритробластов. Отсутствие же синхронного прироста ЭО3 может быть объяснено ускорением их созревания и повторным вовлечением в реконструкцию [2]. С 28-х по 56-е сутки эксперимента у животных в группе 1/2 ЛД50 значительно повысилось содержание ЭО3 при одновременном снижении количества ЭОинв. Учитывая достаточно высокий уровень повторного вовлечения макрофагов ЭО в эритропоэз в эти сроки (в 8,1 раза по сравнению с контролем), можно предположить, что эритропоэз в ЭО в это время приобретал черты компенсационного эритропоэза, при котором возможна дифференциация КОЕэ в «короне» ЭО3. В группе животных с 1/40 ЛД50 на 7-е сутки вовлечение КОЕэ в дифференциацию обеспечивалось повышением ассоциации КОЕэ в проэритробласты, о чем свидетельствует максимальное увеличение содержания ЭО1 - в 9,6 раза в сравнении с контролем. Повышение количества ЭОинв к 56-м суткам эксперимента с одновременным падением количества ЭО3 (в 2,4 раза) по сравнению с 28-ми сутками завершило волну амплификации, которая началась с взаимодействия КОЕэ с ЭОинв : ЭОинв → ЭОрек → ЭО3. К этому же времени возрос показатель вовлечения КОЕэ в дифференциацию в ЭО (в 1,7 раза) и увеличилось количество ЭО1 (в 8,5 раза) по отношению к контролю. То есть новые волны ускоренного деления и дифференциации эритробластов возникли и в «короне» ЭО1, содержащих впервые вовлекаемые в эритропоэз макрофаги. 12.tif Рис. 2. Диаграмма распределения абсолютного количества эритробластических островков костного мозга крыс по классам зрелости в токсигенном периоде после подострого воздействия ПХБ в дозе: а - 1/2 ЛД50; б - 1/40 ЛД50 Функциональные показатели эритропоэза в эритробластических островках костного мозга крыс в токсигенном периоде после подострого воздействия ПХБ (М ± m, р, р1) Показатель Контроль 28-е (подострый период) сутки 7-е сутки 28-е сутки 56-е сутки Доза 1/2 ЛД50 Общее число КОЕэ, вступивших в эритроидную дифференцировку, 103/бедро 286,5 ± 1,87 131,8 ± 4,24 р < 0,05 294,7 ± 91,2 р > 0,05 248,3 ± 91,88 р > 0,05 250,8 ± 8,39 р < 0,05 р1 < 0,05 Показатель интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференциацию, 103/бедро 58,77 ± 1,22 14,67 ± 0,38 р < 0,05 56,0 ± 15,92 р > 0,05 38,23 ± 13,05 р > 0,05 39,43 ± 2,09 р < 0,05 р1 < 0,05 Показатель длительности созревания ЭО, отн. ед. 2,2 ± 0,06 2,13 ± 0,03 р > 0,05 0,36 ± 0,01 р < 0,05 р1 < 0,05 1,7 ± 0,07 р < 0,05 р1 < 0,05 1,55±0,07 р < 0,05 р1 < 0,05 Показатель повторного вовлечения макрофагов ЭО в эритропоэз, отн. ед. 0,37 ± 0,01 0,4 ± 0,0 р > 0,05 1,5 ± 0,0 р < 0,05 р1 < 0,05 3,03 ± 0,04 р < 0,05 р1 < 0,05 3,0 ± 0,0 р < 0,05 р1 < 0,05 Доза 1/40 ЛД50 Общее число КОЕэ, вступивших в эритроидную дифференцировку, 103/ бедро 286,5 ± 1,87 340,6 ± 16,91 р < 0,05 334,8 ± 15,37 р < 0,05 240,0 ± 21,34 р < 0,05 р1 < 0,05 239,6 ± 76,4 р > 0,05 Показатель интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференциацию, 103/ бедро 58,77 ± 1,22 131,3 ± 5,92 р < 0,05 108,0 ± 4,5 р < 0,05 р1 < 0,05 53,0 ± 7,34 р1 < 0,05 103,0 ± 31,6 р > 0,05 Показатель длительности созревания ЭО, отн. ед. 2,2 ± 0,06 0,22 ± 0,01 р < 0,05 0,46 ± 0,01 р < 0,05 р1 < 0,05 0,46 ± 0,01 р < 0,05 р1 < 0,05 0,74 ± 0,05 р < 0,05 р1 < 0,05 Показатель повторного вовлечения макрофагов ЭО в эритропоэз, отн. ед. 0,37 ± 0,01 9,3 ± 1,01 р < 0,05 0,75 ± 0,003 р < 0,05 р1 < 0,05 2,3 ± 0,15 р < 0,05 р1 < 0,05 1,02 ± 0,13 р < 0,05 р1 < 0,05 Примечание: р рассчитано по отношению к данным контрольной группы, р1 рассчитано по отношению к данным 28 суток подострого периода. В целом в данной группе (1/40 ЛД50) в течение эксперимента, особенно в последние 3 недели, отмечалась активация эритропоэза, возможно, стимулированная эритропоэтином. Известно, что в течение этого времени может наблюдаться чередование всплесков активности процессов пролиферации, дифференциации и созревания эритроидных клеток островков в больших объемах, чем в физиологических условиях, а также прирост числа островков пролиферирующих классов, в основном за счет реконструкции эритропоэза в ЭОинв [3]. Первоначальное ускорение темпа дифференцировки КОЕэ в проэритробласты сменялось дозозависимым ответом эритрона в период элиминации токсического агента. Прослеживаемая неравномерная регенерация эритроцитов в ЭО, даже после прекращения введения ПХБ, отражает глубокий повреждающий эффект токсиканта на процессы эритропоэза в ЭО, сохраняя оттенки диз-эритропоэза в ЭО. Таким образом, в группе животных с наибольшей дозой введенного токсиканта (1/2 ЛД50) наблюдалась реакция стресса эритропоэза с последующей активацией компенсационного эритропоэза. В этой группе первоначальная наибольшая активность пролиферативных процессов сменялась к концу опыта (56-е сутки) угнетением эритропоэза в результате срыва адаптивно-компенсаторных реакций с истощением костномозговых резервов. В группе животных с наименьшей дозой введенного интоксиканта (1/40 ЛД50) наблюдались значительные колебания в системе эритрона, что свидетельствует о выраженном кумулятивном действии именно малых доз ПХБ [6]. Прооксидантное действие малых доз ксенобиотика, ведущее к повышенной энергетической потребности, подавлению глюконеогенеза с развитием прогрессирующей гипоксемии в результате воздействия ПХБ, позволяет предположить наличие наиболее сильного гипоксического раздражителя в виде интоксиканта в наименьшей дозе - 1/40 ЛД50 [6]. В группе животных с дозой 1/40 ЛД50 в картине костного мозга в течение эксперимента, особенно в последние 3 недели, прослеживалась выраженная стимуляция эритропоэза, которая, возможно, связана с кислородрегулируемой экспрессией субъединицы α гипоксией индуцированного фактора-1 (ГИФ-1), контролирующей ген эритропоэтина, в клетках почек и крови. Прооксидантное действие малых доз ксенобиотика и, следовательно, последующий рост уровня активных форм кислорода, формирование гипоксической сигнализации геному клетки должны тормозиться благодаря подавлению активности ГИФ-1 увеличенным образованием активных форм кислорода [4, 11]. Однако в этих условиях в подвергнутых гипоксии клетках происходит уменьшение синтеза АТФ и одновременно увеличение эктонуклиотидазной активности во внеклеточной жидкости, активирующей расщепление АТФ до аденозина. В свою очередь, воздействие на рецепторы аденозина на эритропоэтинвоспроизводящих клетках увеличивает продукцию эритропоэтина [7, 8]. Возможно, неоднозначная реакция центрального звена эритрона на гипоксию связана, во-первых, с большей чувствительностью клеток костного мозга к гипоксии, во-вторых, со специфичностью «батареи» генов-мишеней ГИФ-1 для разных типов клеток, экспрессирующихся в ответ на гипоксию [11, 12]. Своевременная диагностика изменений в эритроне становится необходимым условием для оценки общего состояния организма, предупреждения и раннего выявления нарушений в системе крови при воздействиях ПХБ. Выводы Таким образом, результаты проведенной нами работы свидетельствуют о наибольшем повреждающем эффекте малых доз ПХБ, на что указывают количественные и качественные изменения в эритробластических островках, которые продолжают усиливаться в отдаленные сроки эксперимента (2 месяца), что обусловлено более длительным периодом полувыведения меньших доз интоксиканта из организма экспериментальных крыс.

About the authors

A F Kayumova

I R Gabdulkhakova

Email: sabirova.irina@mail.ru

A V Bogdanova

M Ya Fazlyakhmetova

O V Samokhodova

A R Shamratova

References

Supplementary files