Изучение противовоспалительного действия различных средств при лечении хронического пародонтита

Полный текст

Введение

К тканям пародонта относится комплекс тканей, которые окружают зуб и обеспечивают зубодесневое соединение. Развитие хронического пародонтита связано с проявлениями специфической субгингивальной бактериальной флоры из глубоких отделов десневой борозды: экзотоксины и эндотоксины, продуцируемые пародонтопатогенными микроорганизмами, которые приводят к длительному воспалению и разрушению тканей пародонта с последующим образование пародонтальных карманов [1; 2].

Воспаление главным образом опосредуется клетками так называемого моноцитарного звена – нейтрофилами, моноцитами/ макрофагами и Т- и В-лимфоцитами, которые перемещаются в область воспаления путем хемотаксиса, привлекаемые специальными молекулами хемокинами. В результате привлечения клеток моноцитарного звена в очаг воспаления эти клетки вырабатывают медиаторы воспаления, которые способствуют деградации тканей и резорбции кости [3–5]. Одним из известных триггеров воспаления является фактор некроза опухоли (ТНФ-α), который инициирует локальное высвобождение цитокинов, стимулирует адгезию, миграцию и активацию лейкоцитов в месте инвазии. Интерлейкины – наиболее многочисленное семейство цитокинов, которые участвуют в межклеточной коммуникации. Известно, что совместно с инфильтрирующими клетками воспаления (моноциты/макрофаги) десневые фибробласты способны продуцировать цитокины, хемокины и матриксные металлопротеиназы, которые участвуют как в поддержании гомеостаза костной ткани, так и в патогенезе воспаления [6–8]. Фибробласты пародонтальной связки как ключевые клетки соединительной ткани играют важную роль в паракринной сигнализации воспаления, обеспечивая регуляцию различных клеточных функций и процессов, таких как воспаление, регенерация и ремоделирование тканей [9; 10]. Паракринная сигнализация – это форма клеточной коммуникации, при которой фибробласты выделяют сигнальные молекулы (цитокины, факторы роста и другие медиаторы) и действуют на соседние клетки в пределах локальной области. Всё это способствует: привлечению иммунных клеток (моноцитов, макрофагов) к месту воспаления, увеличению проницаемости сосудов, что позволяет лейкоцитам и плазме проникать в ткани и стимулировать регенеративные процессы, способствуя восстановлению поврежденных тканей. В клинической практике применяется специальное средство «Альвостаз-губка» для профилактики и лечения альвеолита.

В связи с этим средство «Альвостаз-губка» предлагается использовать для введения в пародонтальный карман при лечении хронического генерализованного пародонтита средней степени тяжести.

Цель исследования – изучить противовоспалительное действия средства «Альвостаз-губка» для лечения хронического пародонтита.

Материалы и методы исследования

Методика биологического испытания проводилась в лаборатории культур клеток НИИ «БиоТех» СамГМУ, а разработанная сотрудниками «Фибротест-система» была выбрана в качестве клеточной модели in vitro для изучения молекулярного механизма действия специального средства – компресс гемостатический и антисептический для альвеол «Альвостаз-губка». «Фибротест-система» основана на использовании первичной культуры фибробластов человека ювенильного происхождения, которые в ответ на триггеры воспаления продуцируют в культуральную среду хемокины МСР-1, IL-8 и цитокин плейотропного действия IL-6 [11; 12]. В данной работе опосредованный эффект средства «Альвостаз-губка» на клетки оценивали по уровню секреции цитокинов IL-6 и МСР-1, принимающих участие в развитии пародонтального воспаления и поддержании гомеостаза костной ткани.

Исследование проводилось в два этапа:

• – подбор оптимальной концентрации TNF-α (ФНО) для проведения индукции выработки IL-6 и MCP-1;
• – воздействие экстрактом с оптимальной концентрацией TNF-α для определения эффекта действия средства.

Приготовление экстракта из средства «Альвостаз-губка» осуществлялось согласно ГОСТ Р ИСО 10993.12-99. В культуральную жидкость М199 («БиолоТ», Россия), помещали средство «Альвостаз-губка» и оставляли на 24 ч при перемешивании на магнитной мешалке. Для стерилизации экстракт фильтровали через 0.22 μm фильтр, далее проводили серийное разведение полученного экстракта в концентрациях 2х, 4х, 8х, 16х, 32х и 64х.

Культура ювенильных фибробластов человека была получена как описано в [13].

Культуру клеток после разморозки культивировали в питательной среде 199 («БиолоТ», Россия), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, «БиолоТ», Россия) и 40 мкг/мл гентамицина («Дальхимфарм», Россия), до образования субконфлюентного монослоя и пересевали с помощью версен-трипсина («Биолот», Россия) в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (ТРР, Швейцария) для проведения TNF-α (SciStore, Россия) стимуляции.

Жизнеспособность клеток оценивали путем проведения МТТ-теста, который измеряет способность жизнеспособных клеток превращать растворимую соль тетразолия в нерастворимый осадок формазана пурпурного цвета. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 540 мм.

Титрование триггера воспаления TNF-α проводили путем серийного 10-кратного разведения TNF-α. В лунки, содержащие культуру клеток фибробластов человека, добавляли 200 мкл раствора TNF-α в конечной концентрации 200; 20; 2; 0,2; 0,02; 0,002; 0,0002 нг/мл.

Для тестирования действия средства «Альвостаз-губки», смесь 5 нг/мл TNF-α с серийно разведенным экстрактом «Альвостаз-губка» добавляли в лунки, содержащие культуру клеток фибробластов человека, с последующей инкубацией клеток в СО₂-инкубаторе. Через 20 ± 2 ч осуществляли сбор питательных сред из лунок 96-луночного планшета в эппендорфы. Культуральные среды хранили при -20 °С для последующего иммуноферментного анализа (ИФА).

ИФА-анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя наборов ИФА-IL-6 и ИФА МСР-1 («Вектор-Бест»). Чувствительность ИФА составляла 0,5 пг/мл для IL-6 и 15 пг/мл для MCP-1.

Проведено обследование и лечение по обращаемости 74 пациентов с диагнозом хронического генерализованного пародонтита средней степени тяжести (по МКБ-10 К05.31), из них 49 женщин и 25 мужчин, возраст пациентов от 32 до 67 лет. Пациенты были распределены на две группы. Основная группа (n = 30): в пародонтальные карманы вводили средство «Альвастаз-губка», а в группе сравнения (n = 44) вводили остеопластический биокомпозиционный материал «КоллапАн М» (состав: искусственный гидроксиапатит, коллаген, антимикробное средство).

Результаты и их обсуждение

Для определения оптимальной дозы TNF-α для стимуляции синтеза цитокинов IL-6 и МСР-1 в первой серии экспериментов была выбрана оптимальная концентрация TNF-α для стимуляции воспаления в клеточной культуре фибробластов. Провоспалительный эффект TNF-α на культуру фибробластов человека оценивали по уровню секреции цитокинов IL-6 и МСР-1, принимающих участие в развитии пародонтального воспале ния. Кондиционированная среда от клеток, не обработанных TNF-α (0), содержала следовые количества данных факторов (рис. 1).

 

 

Рис. 1. Продукция MCP-1 (а) и IL-6 (б) в ответ на стимуляцию триггером воспаления ТНФ-α. Концентрация цитокинов в культуральной среде первичной культуры клеток фибробластов увеличивалась пропорционально возрастанию концентрации TNF-α (0,2–200 нг/мл)

 

После обработки клеток TNF-α в концентрации от 0,2 до 200 нг/мл содержание цитокинов в кондиционированной среде возрастало пропорционально дозам TNF-α. Контрольные «Альвостаз-губка» с помощью МТТ-теста

фибробласты (0 нг/мл ТНФ) продуцировали 2,08 ± 0,47 пг/мл IL-6 и 18,27 ± 1,66 пг/мл МСР-1 (см. рис. 1). Анализ результатов показал, что дозы TNF-α в пределах 2–10 нг/мл были оптимальными для стимуляции продукции обоих цитокинов.

Присутствие в культуральной среде TNF-α в концентрации 5нг/мл приводит к накоплению фибробластов МСР-1 и IL-6 до »7500 и »1000 пг/мл соответственно. Таким образом, TNF-α-стимулированные фибробласты вырабатывают в клеточную среду в сотни раз больше МСР-1 и IL-6 по сравнению с контрольными, не стимулированными клетками.

Для определения цитотоксичности «Альвостаз-губки» был проведен МТТ-тест через 48 ч после обработки TNF-α-стимулированных фибробластов экстрактом «Альвостаз-губки» в разведении 1х, 2х, 4х, 8х, 16х, 32х, 64х. Контрольные клетки (100 % жизнеспособность) – это клетки, которые выращивали in vitro в среде, не содержащей средство «Альвостаз-губка». Обращает на себя внимание тот факт, что, начиная с разведения экстракта 8х, клетки демонстрируют стабильную жизнеспособность, сопоставимую с контрольными данными (рис. 2).

 

Рис. 2. Определение жизнеспособности культуры фибробластов человека в присутствии экстракта средства

 

Таким образом, в рамках 2-й серии экспериментов стимуляцию триггером воспаления TNF-α (5 нг/мл) проводили в присутствии серийных разведений экстракта «Альвостаз-губки» (8х–64х), при которых клетки демонстрируют стабильную жизнеспособность в пределах 80–90 %.

Нестимулированные фибробласты (без ТНФ) демонстрируют отсутствие продукции цитокина IL-6. Концентрация IL-6 в культуральной среде TNF-α-стимулированных фибробластов меняется в зависимости от степени разбавления экстракта (8х, 16х, 32х, 64х), что показано на рис. 3.

 

Рис. 3. ИФА-анализ IL-6 в культуральной среде нестимулированных фибробластов (без TNF-α) и стимулированных триггером воспаления TNF-α (+TNF-α)

 

Рис. 4. Про- и противовоспалительные реакции IL-6

 

Рис. 5. ИФА-анализ МСР-1 в культуральной среде нестимулированных фибробластов (без TNF-α) и стимулированных триггером воспаления TNF-α (+TNF-α)

 

IL-6 – цитокин плейотропного действия, участвующий не только в реакциях воспаления, но и в регуляции обменных и регенеративных процессов [10]. Плейотропные биологические эффекты IL-6 определяются уникальной сигнальной системой, включающей IL-6-рецепторы (мембранный аналог IL-6R или цитоплазматический аналог sIL-6R) и сигнальные молекулы gp130. IL-6, действуя через мембранно-связанный IL-6R, обладает регенеративным и противовоспалительным действием. Ответы на IL-6 через sIL-6R являются провоспалительными (рис. 4). При классической передаче сигналов IL-6 стимулирует клетки-мишени через мембранно-связанный рецептор интерлейкина-6 (IL-6R), который экспрессируется только на некоторых клетках (макрофаги, нейтрофилы и др.). В кровяном русле и некоторых тканях присутствует растворимая (s) форма sIL-6R, которая в комбинации с IL-6 активирует транс-сигнальную активацию посредством связывания с рецептором gp130, присутствующим практически на всех клетках организма человека. Полагают, что «транс-сигнализация» в большей степени определяет «патогенные» эффекты IL-6, чем «классическая» сигнализация [11].

Учитывая результаты клинических исследований, наличие средства «Альвостаз-губка» в пародонтальном пространстве приводит к активации IL-6 классического каскада сигнальных реакций, которые опосредуют противовоспалительное и регенеративное действие препарата.

Не стимулированные триггером воспаления фибробласты демонстрируют низкий конститутивный уровень продукции хемокина МСР-1 (рис. 5). Однако в присутствии TNF-α продукция МСР-1 резко возрастает: концентрация MCP-1 в культуральной среде фибробластов меняется в зависимости от степени разбавления экстракта (8х, 16х, 32х, 64х) (см. рис. 5). Высокие дозы (8х) экстракта «Альвостаз-губки» полностью ингибируют продукцию МСР-1 до уровня продукции контрольными фибробластами. Уменьшение концентрации экстракта «Альвостаз-губка» (8х, 16х, 32х, 64х) в культуральной среде приводит к дозозависимому увеличению синтеза МСР-1.

Таким образом, экстракт средства «Альвостаз-губка» обладает МСР-1 ингибирующими характеристиками. Для снятия воспалительного процесса ведется активный поиск антагонистов МСР-1, действие которых направлено на ограничение миграции лейкоцитов. Исследуются противовоспалительные свойства ингибирующих МСР-1 моноклональных антител, мутантных рекомбинантных форм МСР-1, ингибиторов вирусной природы и др.

Результаты клинического наблюдения показали, что предлагаемое средство «Альвостаз-губка» снимает воспаление и боль, оказывает терапевтическое действие в течение нескольких часов, после чего начинает постепенно рассасываться. (http://omegadent.ru/ catalog/gemostatiki/483/). Следует отметить, что при однократном введение средства «Альвостаз-губка» через 48 ч пациенты жалоб не предъявляли, десна бледно-розового цвета, плотно прилегает к зубам, экссудат в пародонтальных карманах отсутствовал, глубина пародонтальных карманов менее 3 мм, а до лечения определялась до 5 мм.

В группе сравнения у пациентов после лечения пародонтальных карманов с применением средства «КоллапАн М» отмечался дискомфорт в полости рта, сохранялась незначительная гиперемия в области десневого края и кровоточивость, экссудат отсутствовал, сохранялась подвижность зубов в течение пяти дней, отмечалось постепенное уменьшение глубины пародонтальных карманов с 5 мм (до лечения) до 3,5 мм (после лечения).

Таким образом, молекулярный механизм действия средства «Альвостаз-губка» при лечении пародонтальных карманов позволяет за короткий срок купировать воспаление в тканях пародонта и достичь более длительных сроков ремиссии, а продолжительное противомикробное действие способствует обратному развитию воспалительно-деструктивного процесса тканей пародонта.

Выводы

Проведенные исследования продемонстрировали, что средство «Альвостаз-губка» является мощным ингибитором продукции хемокина МСР-1, что ограничивает миграцию клеток моноцитарного звена в зону пародонтального пространства и приводит к предотвращению воспалительного каскада, опосредуемого моноцитами/макрофагами. Параллельно с МСР-1-ингибирующим действием средство «Альвостаз-губка» стимулирует умеренную продукцию IL-6. Основываясь на результатах клинических исследований, демонстрирующих ускоренное восстановление пародонтального комплекса, можно предположить, что умеренная стимуляция продукции IL-6 опосредует классический IL-6-каскад активации сигнальных молекул, который связан с противовоспалительным и регенеративным действием.

Анализ результатов проведенного лечения пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести с применением средства «Альвостаз-губка» позволяет повысить эффективность лечения и сократить сроки реабилитации пациентов.

Об авторах

Ю. Н. Батталова

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: battalovastoma@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0000-2378-0378
SPIN-код: 7321-5842
Scopus Author ID: 1241873
ResearcherId: KHC-9474-2024

врач стоматолог-терапевт

Россия, г. Москва

М. А. Постников

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Email: battalovastoma@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2232-8870

доктор медицинских наук, заведующий кафедрой терапевтической стоматологии

Россия, г. Москва

С. Е. Чигарина

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Email: apelisin91@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7008-5981

кандидат медицинских наук, доцент кафедры терапевтической стоматологии

Россия, г. Москва

Л. Т. Волова

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Email: battalovastoma@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8510-3118

доктор медицинских наук, профессор, директор биотехнологического центра «Биотех»

Россия, г. Москва

Н. К. Осина

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Email: battalovastoma@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0444-8174
SPIN-код: 6054-3300
Scopus Author ID: 6508362133

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Научно-исследовательского института биотехнологий

Россия, г. Москва

Е. И. Пугачев

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Email: battalovastoma@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3594-0874
SPIN-код: 6700-2103

научный сотрудник Научно-исследовательского института биотехнологий

Россия, г. Москва

Т. В. Старикова

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Email: battalovastoma@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3811-3807
SPIN-код: 9729-6496

главный специалист Научно-исследовательского института биотехнологий

Россия, г. Москва

Н. А. Рябов

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Email: battalovastoma@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1332-953X

кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией биопринтинга Научно-исследовательского института биотехнологий

Россия, г. Москва

С. А. Гончаренко

Национальный медицинский исследовательский центр высоких медицинских технологий – Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского Министерства обороны Российской Федерации

Email: battalovastoma@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8460-9053

лаборант Научно-исследовательского института биотехнологий

Россия, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы