The study of anti-inflammatory action of various remedies in the treatment of chronic periodontitis

Yu. N. Battalova; Батталова Ю. Н.; M. A. Postnikov; Постников М. А.; S. E. Chigarina; Чигарина С. Е.; L. T. Volova; Волова Л. Т.; N. K. Osina; Осина Н. К.; E. I. Pugachev; Пугачев Е. И.; T. V. Starikova; Старикова Т. В.; N. A. Ryabov; Рябов Н. А.; S. A. Goncharenko; Гончаренко С. А.

doi:10.17816/pmj42238-46

The study of anti-inflammatory action of various remedies in the treatment of chronic periodontitis

Authors: Battalova Y.N.¹, Postnikov M.A.¹, Chigarina S.E.¹, Volova L.T.¹, Osina N.K.¹, Pugachev E.I.¹, Starikova T.V.¹, Ryabov N.A.¹, Goncharenko S.A.¹
Affiliations:
1. National Medical Research Center for High Medical Technologies – A.A. Vishnevsky Central Military Clinical Hospital
Issue: Vol 42, No 2 (2025)
Pages: 38-46
Section: Original studies
Submitted: 24.11.2024
Published: 27.05.2025
URL: https://permmedjournal.ru/PMJ/article/view/642193
DOI: https://doi.org/10.17816/pmj42238-46
ID: 642193

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Objective. To study the anti-inflammatory effects of the “Alvostaz-sponge” medical product for the treatment of chronic periodontitis.

Materials and methods. The culture of juvenile human dermal fibroblasts was treated with TNF-α (1st series of experiments) and a mixture of TNF-α with “Alvostaz-sponge” extract (2nd series of experiments). The concentration of cytokines IL-6, MCP-1 in the culture medium of fibroblasts was assessed using enzyme immunoassay (ELISA). The examination and treatment of 74 patients (49 women and 25 men), with a diagnosis of chronic generalized periodontitis of moderate severity were carried out.

Results. In response to TNF-α stimulated inflammation, fibroblasts sharply increased the production of both chemokine MCP-1 and the inflammatory mediator IL-6 into the culture medium. A dose-dependent rise of “Alvostaz-sponge” extract content in the culture medium correlated with a decrease in the concentration of MCP-1, which indicates a pronounced inhibitory effect of “Alvostaz-sponge” extract on the production of MCP-1 cytokine. An increase in the concentration of IL-6 correlated with a dose-dependent increase in the extract of “Alvostaz sponge” in the culture medium of TNF-α-stimulated fibroblasts.

Conclusions. The results of the study demonstrated “Alvostaz-sponge” medication to be a powerful inhibitor of chemokine MCP-1 production and, it is due to this effect that it restricts the monocyte cells migration into the periodontal pocket zone. The obtained results of the treatment show accelerated healing of the periodontal complex when using the “Alvostaz-sponge” remedy.

Keywords

In vitro, cytokines, fibroblasts, periodontal pocket, chronic periodontitis of moderate severity

Full Text

Введение

К тканям пародонта относится комплекс тканей, которые окружают зуб и обеспечивают зубодесневое соединение. Развитие хронического пародонтита связано с проявлениями специфической субгингивальной бактериальной флоры из глубоких отделов десневой борозды: экзотоксины и эндотоксины, продуцируемые пародонтопатогенными микроорганизмами, которые приводят к длительному воспалению и разрушению тканей пародонта с последующим образование пародонтальных карманов [1; 2].

Воспаление главным образом опосредуется клетками так называемого моноцитарного звена – нейтрофилами, моноцитами/ макрофагами и Т- и В-лимфоцитами, которые перемещаются в область воспаления путем хемотаксиса, привлекаемые специальными молекулами хемокинами. В результате привлечения клеток моноцитарного звена в очаг воспаления эти клетки вырабатывают медиаторы воспаления, которые способствуют деградации тканей и резорбции кости [3–5]. Одним из известных триггеров воспаления является фактор некроза опухоли (ТНФ-α), который инициирует локальное высвобождение цитокинов, стимулирует адгезию, миграцию и активацию лейкоцитов в месте инвазии. Интерлейкины – наиболее многочисленное семейство цитокинов, которые участвуют в межклеточной коммуникации. Известно, что совместно с инфильтрирующими клетками воспаления (моноциты/макрофаги) десневые фибробласты способны продуцировать цитокины, хемокины и матриксные металлопротеиназы, которые участвуют как в поддержании гомеостаза костной ткани, так и в патогенезе воспаления [6–8]. Фибробласты пародонтальной связки как ключевые клетки соединительной ткани играют важную роль в паракринной сигнализации воспаления, обеспечивая регуляцию различных клеточных функций и процессов, таких как воспаление, регенерация и ремоделирование тканей [9; 10]. Паракринная сигнализация – это форма клеточной коммуникации, при которой фибробласты выделяют сигнальные молекулы (цитокины, факторы роста и другие медиаторы) и действуют на соседние клетки в пределах локальной области. Всё это способствует: привлечению иммунных клеток (моноцитов, макрофагов) к месту воспаления, увеличению проницаемости сосудов, что позволяет лейкоцитам и плазме проникать в ткани и стимулировать регенеративные процессы, способствуя восстановлению поврежденных тканей. В клинической практике применяется специальное средство «Альвостаз-губка» для профилактики и лечения альвеолита.

В связи с этим средство «Альвостаз-губка» предлагается использовать для введения в пародонтальный карман при лечении хронического генерализованного пародонтита средней степени тяжести.

Цель исследования – изучить противовоспалительное действия средства «Альвостаз-губка» для лечения хронического пародонтита.

Материалы и методы исследования

Методика биологического испытания проводилась в лаборатории культур клеток НИИ «БиоТех» СамГМУ, а разработанная сотрудниками «Фибротест-система» была выбрана в качестве клеточной модели in vitro для изучения молекулярного механизма действия специального средства – компресс гемостатический и антисептический для альвеол «Альвостаз-губка». «Фибротест-система» основана на использовании первичной культуры фибробластов человека ювенильного происхождения, которые в ответ на триггеры воспаления продуцируют в культуральную среду хемокины МСР-1, IL-8 и цитокин плейотропного действия IL-6 [11; 12]. В данной работе опосредованный эффект средства «Альвостаз-губка» на клетки оценивали по уровню секреции цитокинов IL-6 и МСР-1, принимающих участие в развитии пародонтального воспаления и поддержании гомеостаза костной ткани.

Исследование проводилось в два этапа:

– подбор оптимальной концентрации TNF-α (ФНО) для проведения индукции выработки IL-6 и MCP-1;
– воздействие экстрактом с оптимальной концентрацией TNF-α для определения эффекта действия средства.

Приготовление экстракта из средства «Альвостаз-губка» осуществлялось согласно ГОСТ Р ИСО 10993.12-99. В культуральную жидкость М199 («БиолоТ», Россия), помещали средство «Альвостаз-губка» и оставляли на 24 ч при перемешивании на магнитной мешалке. Для стерилизации экстракт фильтровали через 0.22 μm фильтр, далее проводили серийное разведение полученного экстракта в концентрациях 2х, 4х, 8х, 16х, 32х и 64х.

Культура ювенильных фибробластов человека была получена как описано в [13].

Культуру клеток после разморозки культивировали в питательной среде 199 («БиолоТ», Россия), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, «БиолоТ», Россия) и 40 мкг/мл гентамицина («Дальхимфарм», Россия), до образования субконфлюентного монослоя и пересевали с помощью версен-трипсина («Биолот», Россия) в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (ТРР, Швейцария) для проведения TNF-α (SciStore, Россия) стимуляции.

Жизнеспособность клеток оценивали путем проведения МТТ-теста, который измеряет способность жизнеспособных клеток превращать растворимую соль тетразолия в нерастворимый осадок формазана пурпурного цвета. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 540 мм.

Титрование триггера воспаления TNF-α проводили путем серийного 10-кратного разведения TNF-α. В лунки, содержащие культуру клеток фибробластов человека, добавляли 200 мкл раствора TNF-α в конечной концентрации 200; 20; 2; 0,2; 0,02; 0,002; 0,0002 нг/мл.

Для тестирования действия средства «Альвостаз-губки», смесь 5 нг/мл TNF-α с серийно разведенным экстрактом «Альвостаз-губка» добавляли в лунки, содержащие культуру клеток фибробластов человека, с последующей инкубацией клеток в СО₂-инкубаторе. Через 20 ± 2 ч осуществляли сбор питательных сред из лунок 96-луночного планшета в эппендорфы. Культуральные среды хранили при -20 °С для последующего иммуноферментного анализа (ИФА).

ИФА-анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя наборов ИФА-IL-6 и ИФА МСР-1 («Вектор-Бест»). Чувствительность ИФА составляла 0,5 пг/мл для IL-6 и 15 пг/мл для MCP-1.

Проведено обследование и лечение по обращаемости 74 пациентов с диагнозом хронического генерализованного пародонтита средней степени тяжести (по МКБ-10 К05.31), из них 49 женщин и 25 мужчин, возраст пациентов от 32 до 67 лет. Пациенты были распределены на две группы. Основная группа (n = 30): в пародонтальные карманы вводили средство «Альвастаз-губка», а в группе сравнения (n = 44) вводили остеопластический биокомпозиционный материал «КоллапАн М» (состав: искусственный гидроксиапатит, коллаген, антимикробное средство).

Результаты и их обсуждение

Для определения оптимальной дозы TNF-α для стимуляции синтеза цитокинов IL-6 и МСР-1 в первой серии экспериментов была выбрана оптимальная концентрация TNF-α для стимуляции воспаления в клеточной культуре фибробластов. Провоспалительный эффект TNF-α на культуру фибробластов человека оценивали по уровню секреции цитокинов IL-6 и МСР-1, принимающих участие в развитии пародонтального воспале ния. Кондиционированная среда от клеток, не обработанных TNF-α (0), содержала следовые количества данных факторов (рис. 1).

Рис. 1. Продукция MCP-1 (а) и IL-6 (б) в ответ на стимуляцию триггером воспаления ТНФ-α. Концентрация цитокинов в культуральной среде первичной культуры клеток фибробластов увеличивалась пропорционально возрастанию концентрации TNF-α (0,2–200 нг/мл)

После обработки клеток TNF-α в концентрации от 0,2 до 200 нг/мл содержание цитокинов в кондиционированной среде возрастало пропорционально дозам TNF-α. Контрольные «Альвостаз-губка» с помощью МТТ-теста

фибробласты (0 нг/мл ТНФ) продуцировали 2,08 ± 0,47 пг/мл IL-6 и 18,27 ± 1,66 пг/мл МСР-1 (см. рис. 1). Анализ результатов показал, что дозы TNF-α в пределах 2–10 нг/мл были оптимальными для стимуляции продукции обоих цитокинов.

Присутствие в культуральной среде TNF-α в концентрации 5нг/мл приводит к накоплению фибробластов МСР-1 и IL-6 до »7500 и »1000 пг/мл соответственно. Таким образом, TNF-α-стимулированные фибробласты вырабатывают в клеточную среду в сотни раз больше МСР-1 и IL-6 по сравнению с контрольными, не стимулированными клетками.

Для определения цитотоксичности «Альвостаз-губки» был проведен МТТ-тест через 48 ч после обработки TNF-α-стимулированных фибробластов экстрактом «Альвостаз-губки» в разведении 1х, 2х, 4х, 8х, 16х, 32х, 64х. Контрольные клетки (100 % жизнеспособность) – это клетки, которые выращивали in vitro в среде, не содержащей средство «Альвостаз-губка». Обращает на себя внимание тот факт, что, начиная с разведения экстракта 8х, клетки демонстрируют стабильную жизнеспособность, сопоставимую с контрольными данными (рис. 2).

Рис. 2. Определение жизнеспособности культуры фибробластов человека в присутствии экстракта средства

Таким образом, в рамках 2-й серии экспериментов стимуляцию триггером воспаления TNF-α (5 нг/мл) проводили в присутствии серийных разведений экстракта «Альвостаз-губки» (8х–64х), при которых клетки демонстрируют стабильную жизнеспособность в пределах 80–90 %.

Нестимулированные фибробласты (без ТНФ) демонстрируют отсутствие продукции цитокина IL-6. Концентрация IL-6 в культуральной среде TNF-α-стимулированных фибробластов меняется в зависимости от степени разбавления экстракта (8х, 16х, 32х, 64х), что показано на рис. 3.

Рис. 3. ИФА-анализ IL-6 в культуральной среде нестимулированных фибробластов (без TNF-α) и стимулированных триггером воспаления TNF-α (+TNF-α)

Рис. 4. Про- и противовоспалительные реакции IL-6

Рис. 5. ИФА-анализ МСР-1 в культуральной среде нестимулированных фибробластов (без TNF-α) и стимулированных триггером воспаления TNF-α (+TNF-α)

IL-6 – цитокин плейотропного действия, участвующий не только в реакциях воспаления, но и в регуляции обменных и регенеративных процессов [10]. Плейотропные биологические эффекты IL-6 определяются уникальной сигнальной системой, включающей IL-6-рецепторы (мембранный аналог IL-6R или цитоплазматический аналог sIL-6R) и сигнальные молекулы gp130. IL-6, действуя через мембранно-связанный IL-6R, обладает регенеративным и противовоспалительным действием. Ответы на IL-6 через sIL-6R являются провоспалительными (рис. 4). При классической передаче сигналов IL-6 стимулирует клетки-мишени через мембранно-связанный рецептор интерлейкина-6 (IL-6R), который экспрессируется только на некоторых клетках (макрофаги, нейтрофилы и др.). В кровяном русле и некоторых тканях присутствует растворимая (s) форма sIL-6R, которая в комбинации с IL-6 активирует транс-сигнальную активацию посредством связывания с рецептором gp130, присутствующим практически на всех клетках организма человека. Полагают, что «транс-сигнализация» в большей степени определяет «патогенные» эффекты IL-6, чем «классическая» сигнализация [11].

Учитывая результаты клинических исследований, наличие средства «Альвостаз-губка» в пародонтальном пространстве приводит к активации IL-6 классического каскада сигнальных реакций, которые опосредуют противовоспалительное и регенеративное действие препарата.

Не стимулированные триггером воспаления фибробласты демонстрируют низкий конститутивный уровень продукции хемокина МСР-1 (рис. 5). Однако в присутствии TNF-α продукция МСР-1 резко возрастает: концентрация MCP-1 в культуральной среде фибробластов меняется в зависимости от степени разбавления экстракта (8х, 16х, 32х, 64х) (см. рис. 5). Высокие дозы (8х) экстракта «Альвостаз-губки» полностью ингибируют продукцию МСР-1 до уровня продукции контрольными фибробластами. Уменьшение концентрации экстракта «Альвостаз-губка» (8х, 16х, 32х, 64х) в культуральной среде приводит к дозозависимому увеличению синтеза МСР-1.

Таким образом, экстракт средства «Альвостаз-губка» обладает МСР-1 ингибирующими характеристиками. Для снятия воспалительного процесса ведется активный поиск антагонистов МСР-1, действие которых направлено на ограничение миграции лейкоцитов. Исследуются противовоспалительные свойства ингибирующих МСР-1 моноклональных антител, мутантных рекомбинантных форм МСР-1, ингибиторов вирусной природы и др.

Результаты клинического наблюдения показали, что предлагаемое средство «Альвостаз-губка» снимает воспаление и боль, оказывает терапевтическое действие в течение нескольких часов, после чего начинает постепенно рассасываться. (http://omegadent.ru/ catalog/gemostatiki/483/). Следует отметить, что при однократном введение средства «Альвостаз-губка» через 48 ч пациенты жалоб не предъявляли, десна бледно-розового цвета, плотно прилегает к зубам, экссудат в пародонтальных карманах отсутствовал, глубина пародонтальных карманов менее 3 мм, а до лечения определялась до 5 мм.

В группе сравнения у пациентов после лечения пародонтальных карманов с применением средства «КоллапАн М» отмечался дискомфорт в полости рта, сохранялась незначительная гиперемия в области десневого края и кровоточивость, экссудат отсутствовал, сохранялась подвижность зубов в течение пяти дней, отмечалось постепенное уменьшение глубины пародонтальных карманов с 5 мм (до лечения) до 3,5 мм (после лечения).

Таким образом, молекулярный механизм действия средства «Альвостаз-губка» при лечении пародонтальных карманов позволяет за короткий срок купировать воспаление в тканях пародонта и достичь более длительных сроков ремиссии, а продолжительное противомикробное действие способствует обратному развитию воспалительно-деструктивного процесса тканей пародонта.

Выводы

Проведенные исследования продемонстрировали, что средство «Альвостаз-губка» является мощным ингибитором продукции хемокина МСР-1, что ограничивает миграцию клеток моноцитарного звена в зону пародонтального пространства и приводит к предотвращению воспалительного каскада, опосредуемого моноцитами/макрофагами. Параллельно с МСР-1-ингибирующим действием средство «Альвостаз-губка» стимулирует умеренную продукцию IL-6. Основываясь на результатах клинических исследований, демонстрирующих ускоренное восстановление пародонтального комплекса, можно предположить, что умеренная стимуляция продукции IL-6 опосредует классический IL-6-каскад активации сигнальных молекул, который связан с противовоспалительным и регенеративным действием.

Анализ результатов проведенного лечения пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести с применением средства «Альвостаз-губка» позволяет повысить эффективность лечения и сократить сроки реабилитации пациентов.