Исследование генов, участвующих в ангиогенезе и в метаболических процессах, лимфоцитов периферической крови у больных хроническим эндометритом

Полный текст

Введение

Сегодня в разных направлениях медицины активно обсуждается рост заболеваний с хроническим течением. Здоровье детей пациенток с наличием эндогенных очагов воспалительной патологии органов репродуктивной системы вызывает много споров у врачей (гинекологов, педиатров, терапевтов). В связи с этим заслуживают внимание вопросы предгравидарной подготовки, в том числе больных хроническим эндометритом (ХЭ) [1, 2].

Хронический неспецифический эндометрит относится к болезням множественной этиологии; дискутабельны, активно изучаются патогенетические механизмы этого заболевания, роль персистирующей бактериально-вирусной инфекции, процесс аберрантности локального микроокружения эндометрия, несостоятельность иммунных процессов, роль генов в патогенезе болезни и т.д. Имеются точки зрения, что продолжающаяся антигенная стимуляция иммунной системы (может быть, и собственной микробиотой), экспрессия ряда провоспалительных факторов (клеточного и гуморального звена), изменение активности макрофагов, иммуноглобулинов и иммунных комплексов, длительно циркулирующих в организме, дисбаланс цитокинов, изменение ряда генов и т.д. поддерживают хроническое воспаление в матке [1–4].

Исследований по проблеме ХЭ как в России, так и за рубежом много. В свете разнонаправленного анализа данного заболевания вызывает интерес роль генных полиморфизмов у таких больных. Здоровье в большей части ассоциировано с функциональной полноценностью и слаженным действием разных систем организма (иммунной, гормональной и т.д.). Геном человека содержит много полиморфных нуклеотидов, экспрессия кодируемого белка проявляется в зависимости от варианта изменения последовательности SNPs (single nucleotide polimorphisme), и нет в популяции людей, абсолютно совпадающих фенотипически и генотипически, поэтому представляется актуальным исследование генов у пациенток с такой трудно поддающейся лечению патологией в гинекологии, как ХЭ [5, 6]. Изменение одного гена вряд ли оказывает значимое патологическое влияние на формирование и течение ХЭ как болезни, конечный эффект, скорее всего, зависит от взаимодействия группы генов и их влияния на патогенез в целом.

Научных исследований, касающихся влияния оксида азота на патогенез акушерско-гинекологических осложнений, немного, изучается роль гена eNOs при репродуктивных нарушениях: в частности, у больных с выкидышами в анамнезе определяли полиморфизм гена eNО и VEGF [7–9]. Исследовался ген аполипопротеина Е (ApoE) в аспекте нарушения обмена липидов у больных, захвата холестерола и в процессах стероидогенеза с позиции нарушения антиоксидантной активности в клетке и метаболизма клеточной мембраны, полиморфизм генов eNOS, ApoE, MTHFR у больных с репродуктивными нарушениями [10–13]. Вызывает интерес роль ApoE при воспалительных процессах – его влияние на функцию циркулирующих макрофагов в очаге воспалительного процесса, на активность Th1 и цитокинов [13–15]. Был исследован полиморфизм гена PPARA у больных с нарушением фертильности, получены связи наличия аллели Pro72 у пациенток с привычной потерей беременности в анамнезе, однако в другой работе такая связь не была выявлена, что подчёркивает важность дальнейших исследований этого гена у пациенток с акушерско-гинекологической патологией [16, 17].

Резюмируя вышеизложенное, отметим, что исследование генов и их ассоциации у больных ХЭ актуально, полученные результаты дадут возможность расширить, может быть, под другим ракурсом рассмотреть некоторые части патогенетического механизма хронического эндометрита.

Цель работы – исследование лимфоцитов периферической крови и генов, участвующих в ангиогенезе, в метаболических процессах у больных хроническим эндометритом.

Материалы и методы исследования

Данное исследование проведено ретро- и проспективно на базе кафедры акушерства и гинекологии № 1 ФГБОУ ВО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ. Для сравнения были сформированы две группы: I группа (n = 33) – практически здоровые женщины, II группа (n = 53) – пациентки, имеющие морфологически верифицированный хронический эндометрит в анамнезе. Критериями исключения из исследования были: возраст младше 18 и старше 45 лет, сопутствующие патологии в анамнезе, требующие приема лекарственных препаратов на момент участия (для пациенток всех групп). Выполнено комплексное обследование всех участниц исследования. С применением метода иммуноцитохимии проведена оценка клеточного состава ряда лимфоцитов периферической крови, в частности CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD19⁺, CD95⁺. Генотип определяли с помощью метода аллельной дискриминации, различия гетерозиготного и гомозиготного вариантов выявляли по характеру реакций амплификации соответствующих праймеров. Материалом для исследования служил мазок со слизистой оболочки ротоглотки. Исследование полиморфизма четырех генов проведено с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени. В качестве праймеров использовали участки ДНК генов eNOS 1799983(Glu298Asp), ApoE rs429358(Cys130Arg), PPARA (G2528C), MTHFR (C677T,A1298C), выполнено определение процентного соотношения гомозиготных и гетерозиготных результатов. Все стадии исследования соответствуют законодательству РФ, международным этическим нормам и нормативным документам исследовательских организаций, все участники также подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Для статистического анализа применялись пакеты прикладных программ Microsoft Excel (2010), StatSoft Statistica 6.0 (StatSoft, США), SPSS Statistics, версия 22.0 (IBM Microsoft, США). Количественные параметры по группам представлены в виде средних значений, медианы (Ме) и процентильного интервала (25–75), для сравнения групп использовались непараметрические методы (тест Манна – Уитни), для анализа взаимосвязей между частотой признаков и межгрупповых различий применяли критерий χ², результаты представлены с 95%-ным доверительным интервалом (Q ± q), рассчитывали отношения шансов (ОШ) и отношения рисков (ОР) с доверительным интервалом (ДИ) 95 %.

Результаты и их обсуждение

Первоначально проведен сравнительный анализ клинических данных пациенток, участвующих в исследовании. Средний возраст участниц соответствовал 30,9 ± 2,1 г. в I группе и 33,5 ± 1,8 г. – во II. Получены следующие особенности акушерско-гинекологического анамнеза в группах: выявлена высокая частота медицинских абортов у женщин как в I, так и во II группах – 24,24 ± 15 и 56,6 ± 13,6 % соответственно (χ² = 7,37; p = 0,007; ОШ 4,07; ДИ 95 % 1,55; 10,6). Неудачные исходы беременности в виде неразвивающейся беременности имели место только у больных II группы – 24,5 ± 11,8 % случаев (χ² = 3,68; p = 0,05); выкидыши зафиксированы у 15,15 ± 12 % пациенток с ХЭ и у 26,4 ± 12,1 % в I группе (χ² = 0,03; p = 0,33; ОШ 2,01; ДИ 95 % 0,65; 6,23). Нарушение фертильности (как первичная, так вторичная форма бесплодия) выявлено только у 56,6 ± 13,6 % пациенток II группы – с ХЭ (χ² = 15,7; p = 0,001); роды в I группе имели 33,33 ± 16 % женщин, во II – 37,8 ± 13,4 % (χ² = 0,86; p = 0,03; ОШ 1,21; ДИ 95 % 0,49; 3,02). Дисплазия молочной железы обнаружена преимущественно у больных ХЭ (χ² = 2,83; p = 0,09, ОР 3,59; ДИ 95 % 0,94; 13,6). Особенности гинекологического анамнеза представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Особенности гинекологического анамнеза у участниц исследования: * – р < 0,001 – различия статистически значимы

 

Анализ сопутствующей соматической патологии у пациенток, участвующих в исследовании, продемонстрировал значимые отличия в группе тех, кто имеет ХЭ, результаты представлены на рис. 2. При расчёте рисков развития статистически значимой сопутствующей патологии в группах выявлено, что имеется значимая разница по заболеванию органов пищеварения: в частности, у женщин II группы были выше риски появления синдрома кишечной диспепсии и патологии жёлчного пузыря (χ² = 32,34, p = 0,001, ОР 2,8; ДИ 95 % 1,9; 4,13); хронический тонзиллит диагностировался чаще у больных ХЭ (χ² = 5,77; p = 0,01, ОР 1,63; ДИ 95 % 1,24; 2,14).

 

Рис. 2. Статистически значимая сопутствующая соматическая патология (%) в группах: * – р < 0,001 – различия статистически значимые

 

По результатам оценки лимфоцитов периферической крови у практически здоровых и пациенток с ХЭ в анамнезе получены статистически значимые различия, в частности, у больных ХЭ Ме лейкоцитов составила 4,9·10⁹/л (4,6–5,7) по сравнению с группой практически здоровых пациенток: Ме = 6,2·10⁹/л (5,3–6,8) (р = 0,001); Ме количества лимфоцитов соответствовала 1,99·10⁹/л (1,66–2,380) в I группе против 2,42·10⁹/л (2,17–3,01) – во II (р = 0,001) (рис. 3). У 67,9 % пациенток II группы установлены более низкие значения Т-лимфоцитов – CD3⁺-клеток, Ме – 65 % (54–70) против 71 % (69–73) в I группе (р = 0,001). У больных ХЭ выявлено снижение индекса лимфоцитов с фенотипом CD3⁺/CD8⁺ – Ме = 19,5 % (12–29,5) – по сравнению с 25 % (22–31) в I группе (р = 0,004). По результатам анализа CD95⁺ у пациенток с ХЭ получили медиану 0,57·10⁹/л (0,48–0,71) против 0,72·10⁹/л (0,65–0,95) (p < 0,001) – у женщин I группы. В I группы в 24,4 ± 15,3 % (8) случаев имелось снижение показателей CD3⁺/CD95⁺ против 90,57 ± 8,06 % (48) случаев во II группе (χ² = 36,52, p < 0,001; ОР = 5,14; ОР 95 % ДИ 2,29;11,5). У 41,5 ± 13 % больных ХЭ количество лимфоцитов с фенотипом CD3⁺/CD4⁺ было снижено. Соотношение хелперов и супрессоров в периферической крови (CD4⁺/CD8⁺) было снижено у 1/3 пациенток, имеющих ХЭ в анамнезе (28,3 ± 12,4 %). У 32,08 ± 12,9 % женщин с ХЭ количество В-клеток CD19⁺ было меньше, чем у практически здоровых пациенток (9 (6–13) против 14 (13–17) % соответственно, р = 0,001). Между снижением количества CD3⁺-лимфоцитов и CD19⁺ получена слабая, но положительная корреляция (r = 0,03,p < 0,05).

 

Рис. 3. Сравнительный анализ количества лимфоцитов периферической крови у практически здоровых женщин (I группа) и больных хроническим эндометритом (II группа)

 

По результатам обследования пациенток установлено, что имеется нормальная гомозигота (G/G) гена ApoE Cys130Arg (rs 429358) у 87,8 ± 11,6 % женщин I группы и у 49,1 ± 13,8 % обследованных II группы (рис. 4), гетерозигота (GС) встретилась у 12,1 ± 11,6 % в I и у 47,2 ± 13,7 % – во II группе (χ² = 11,67; р = 0,001; ОР 1,84; ОР 95%ДИ 1,35; 2,51); патологическая гомозигота (С/С) определена у 3,7 ± 5,3 % пациенток только II группы. Патологическая минорная аллель выявлена у 6,1 % в группе практически здоровых и у 27,4 % пациенток с ХЭ.

 

Рис. 4. Полиморфизм генов PPARA (rs 4253778), eNOS (rs 1799983), MTHFR (rs 1801133), ApoE (rs 429358) у практически здоровых (I группа) и больных ХЭ (II группа) участниц, %: * – р < 0,001 – различия статистически значимые

 

Исследование аллельных вариантов полиморфизма G2528C гена PPARA у пациенток I группы показало, что они чаще имеют генотип G/G – 90,9 ± 10,2 % (30), минорная аллель С была выявлена только у 9,09 ± 10,2 % (3) женщин (р < 0,001). Во II группе пациенток с ХЭ в анамнезе с минорной аллелью С было 35,9 ± 13,2 % женщин, с генотипом С/С – 3,7 ± 5,3 % (р < 0,001). Патологическая минорная аллель наблюдалась у 4,5 % здоровых и у 21,7 % больных ХЭ. Таким образом, сравнение результатов частот гетерозиготного, гомозиготного генотипа, нормальной и патологической аллели гена PPARA (rs4253778) G2528C в I и во II группах участниц исследования продемонстрировало статистически значимую разницу между группами по наличию полиморфизма и минорной аллели (χ² = 7,97; р = 0,005; ОШ 6,56; ОШ 95 %ДИ 1,77; 24,3;), расчет рисков также выявил статистическую значимость: ОР 1,69; ОР 95 % ДИ 1,28; 2,25.

Исследование генотипа и аллелей гена eNOS (rs 1799983) Glu298Asp у практически здоровых участниц показало преобладание генотипа G/G над С/С (χ² = 4,58; р = 0,032); результаты исследования аллельных вариантов Glu298Asp гена eNOS в I группе выявили, что мажорная аллель в виде генотипа G/G имеется у 81,8 ± 13,9 % (27) и минорная аллель С в виде генотипа G/С – у 18,2 ± 13,7 % (6) пациенток (р < 0,001). В группе женщин с ХЭ в анамнезе преобладал полиморфизм, минорная аллель С (генотип G/С) была получена у 52,8 ± 13,2 %, в виде С/С (патологической гомозиготы) – у 5,66 ± 6,37 % (3) женщин (р < 0,001). Патологическая минорная аллель имелась в I группе у 9,09 % пациенток и у 32,1 % – во II (р = 0,01). Таким образом, сравнение результатов гетерозиготного, гомозиготного генотипов, нормальной и патологической аллелей по eNOS Glu298Asp (rs1799983) показало статистически значимую разницу между практически здоровыми и пациентками с ХЭ в анамнезе (χ² = 11,9; р = 0,001; ОШ 6,34; ОШ 95 % ДИ 2,24; 17,94), расчет рисков подтвердил статистическую значимость – ОР 1,87; ОР 95 % ДИ 1,33; 2,62.

Результаты исследования полиморфизма гена MTHFR rs1801133 C677T позволили установить, что нормальную гомозиготу (G/G) имели 93,9 ± 8,5 % женщин I группы и 66 ± 13,1 % пациенток II группы, гетерозиготный генотип (G/С) – 6,06 ± 8,4 и 24,5 ± 11,9 % соответственно, что статистически значимо (χ² = 7,4; р = 0,007; ОР 1,69; ОР 95 % ДИ 1,3; 2,22), патологическая гомозигота (С/С) выявлена у 9,43 ± 8,06 % практический здоровых участниц и у 9,4 ± 8,1 % пациенток с ХЭ в анамнезе. Таким образом, сравнение результатов гетерозиготного, гомозиготного генотипов, нормальной и патологической аллелей гена MTHFR rs1801133 C677T показало статистически значимую разницу между практически здоровыми и пациентками с ХЭ в анамнезе (ОШ 7,97; ОШ 95 % ДИ 1,71; 37,1).

В дальнейшем проведен анализ ассоциации между клинико-анамнестическими данными пациенток и наличием полиморфизма гена. Выявлено, что у женщин с ХЭ (II группа), имеющих неразвивающуюся беременность в анамнезе, чаще наблюдался полиморфизм гена ApoE rs429358 (χ² = 3,38, p = 0,06, ОШ 4,5; ОШ 95 % ДИ 1,07; 18,9), расчет рисков также указал на статистическую значимость данных (ОР 1,81; ОР 95 % ДИ 1,13; 2,89). В этой же группе пациентки с изменением генотипа MTHFR rs18011 чаще имели минорные аллели гена PPAR (χ² = 3,75; p = 0,054; ОШ 4,00; ОШ 95 % ДИ 1,16; 13,83), расчет рисков демонстрирует статистическую значимость (ОР 2,313; ОР 95 % ДИ 1,13; 4,72; r = 0,024 (p < 0,05)); полиморфизм гена MTHFR rs1801 во II группе имели пациентки с патологией органов пищеварения в виде хронического холецистита (χ² = 5,99; p = 0,01) и синдрома кишечной диспепсии в анамнезе (χ² = 5,36; p = 0,02). Пациентки II группы с аномальными маточными кровотечениями в анамнезе чаще были носителями минорной аллели гена PPARArs4253778 (ОР 1,968; ОР 95 % ДИ 1,03; 3,76; r = 0,04 (p < 0,05)). У участниц II группы, имеющих хронический холецистит в анамнезе и снижение индекса CD3⁺CD4⁺, чаще наблюдали полиморфизм гена PPARA 4253778 (r = 0,04; ОШ 0,28; ОШ 95 % ДИ 0,08; 0,93). Пациентки со снижением CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов имели полиморфизм генов ApoE 42935(r = 0,02; ОР 1,24; ОШ 95 % ДИ 1,03; 1,49) и eNOS 1799983 (r = 0,05; ОР 0,84; ОШ 95 % ДИ; 0,72; 0,98).

По результатам проведенного исследования установлено, что пациентки с ХЭ чаще имели хронические заболевания органов пищеварения, дыхания, их акушерско-гинекологический анамнез был отягощен сопутствующей хронической патологией других органов, что подчеркивает роль сочетанного характера воспалительных процессов разных органов в патогенезе ХЭ. Выявлены ассоциации изучаемых локусов генов с клиническими данными больных ХЭ. Результаты иммунологического исследования показали признаки недостаточности клеточного эффекторного звена иммунитета у преобладающей части пациенток с ХЭ, при этом они чаще имели полиморфизм генов PPARA 4253778, ApoE42935 и eNOS 1799983.

Предполагаем, что наличие полиморфизма некоторых генов, но отсутствие патологии эндометрия, нарушения фертильности, более низкие показатели заболеваний органов малого таза и органов пищеварения у практически здоровых участниц исследования подтверждают гипотезу о ведущей роли инфекционного фактора в реализации патологических процессов в матке при ХЭ [1–4].

Выводы

1. Получено преобладание полиморфизма генов eNOS 1799983(Glu298Asp), PPARA (G2528C), ApoE rs429358(Cys130Arg), MTHFR (C677T, A1298C) у больных хроническим воспалением эндометрия по сравнению с практически здоровыми участницами исследования.
2. Выявлена недостаточность клеточного эффекторного звена иммунитета у преобладающей части пациенток с ХЭ, установлены ассоциации аллели С генотипа G/C и С/C гена PPARA 4253778, аллели С генотипа G/C и С/C гена ApoE42935, аллели С генотипа G/C и С/C гена eNOS 1799983, генотипа G/C гена MTHFR (C677T, A1298C) с клиническими данными участниц.
3. Результаты исследования показывают, что нужны дальнейшие исследования генов eNOS 1799983, PPARA, ApoE у пациенток с хроническими воспалительными процессами малого таза в анамнезе.

Об авторах

Екатерина Глахоевна Кобаидзе

Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера

Автор, ответственный за переписку.
Email: eka7i@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0001-5042-1549
SPIN-код: 1585-3296
Scopus Author ID: 57219650638

доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии № 1

Россия, г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы