Study of genes involved in angiogenesis and metabolic processes of peripheral blood lymphocytes in patients with chronic endometritis

Full Text

Введение

Сегодня в разных направлениях медицины активно обсуждается рост заболеваний с хроническим течением. Здоровье детей пациенток с наличием эндогенных очагов воспалительной патологии органов репродуктивной системы вызывает много споров у врачей (гинекологов, педиатров, терапевтов). В связи с этим заслуживают внимание вопросы предгравидарной подготовки, в том числе больных хроническим эндометритом (ХЭ) [1, 2].

Хронический неспецифический эндометрит относится к болезням множественной этиологии; дискутабельны, активно изучаются патогенетические механизмы этого заболевания, роль персистирующей бактериально-вирусной инфекции, процесс аберрантности локального микроокружения эндометрия, несостоятельность иммунных процессов, роль генов в патогенезе болезни и т.д. Имеются точки зрения, что продолжающаяся антигенная стимуляция иммунной системы (может быть, и собственной микробиотой), экспрессия ряда провоспалительных факторов (клеточного и гуморального звена), изменение активности макрофагов, иммуноглобулинов и иммунных комплексов, длительно циркулирующих в организме, дисбаланс цитокинов, изменение ряда генов и т.д. поддерживают хроническое воспаление в матке [1–4].

Исследований по проблеме ХЭ как в России, так и за рубежом много. В свете разнонаправленного анализа данного заболевания вызывает интерес роль генных полиморфизмов у таких больных. Здоровье в большей части ассоциировано с функциональной полноценностью и слаженным действием разных систем организма (иммунной, гормональной и т.д.). Геном человека содержит много полиморфных нуклеотидов, экспрессия кодируемого белка проявляется в зависимости от варианта изменения последовательности SNPs (single nucleotide polimorphisme), и нет в популяции людей, абсолютно совпадающих фенотипически и генотипически, поэтому представляется актуальным исследование генов у пациенток с такой трудно поддающейся лечению патологией в гинекологии, как ХЭ [5, 6]. Изменение одного гена вряд ли оказывает значимое патологическое влияние на формирование и течение ХЭ как болезни, конечный эффект, скорее всего, зависит от взаимодействия группы генов и их влияния на патогенез в целом.

Научных исследований, касающихся влияния оксида азота на патогенез акушерско-гинекологических осложнений, немного, изучается роль гена eNOs при репродуктивных нарушениях: в частности, у больных с выкидышами в анамнезе определяли полиморфизм гена eNО и VEGF [7–9]. Исследовался ген аполипопротеина Е (ApoE) в аспекте нарушения обмена липидов у больных, захвата холестерола и в процессах стероидогенеза с позиции нарушения антиоксидантной активности в клетке и метаболизма клеточной мембраны, полиморфизм генов eNOS, ApoE, MTHFR у больных с репродуктивными нарушениями [10–13]. Вызывает интерес роль ApoE при воспалительных процессах – его влияние на функцию циркулирующих макрофагов в очаге воспалительного процесса, на активность Th1 и цитокинов [13–15]. Был исследован полиморфизм гена PPARA у больных с нарушением фертильности, получены связи наличия аллели Pro72 у пациенток с привычной потерей беременности в анамнезе, однако в другой работе такая связь не была выявлена, что подчёркивает важность дальнейших исследований этого гена у пациенток с акушерско-гинекологической патологией [16, 17].

Резюмируя вышеизложенное, отметим, что исследование генов и их ассоциации у больных ХЭ актуально, полученные результаты дадут возможность расширить, может быть, под другим ракурсом рассмотреть некоторые части патогенетического механизма хронического эндометрита.

Цель работы – исследование лимфоцитов периферической крови и генов, участвующих в ангиогенезе, в метаболических процессах у больных хроническим эндометритом.

Материалы и методы исследования

Данное исследование проведено ретро- и проспективно на базе кафедры акушерства и гинекологии № 1 ФГБОУ ВО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ. Для сравнения были сформированы две группы: I группа (n = 33) – практически здоровые женщины, II группа (n = 53) – пациентки, имеющие морфологически верифицированный хронический эндометрит в анамнезе. Критериями исключения из исследования были: возраст младше 18 и старше 45 лет, сопутствующие патологии в анамнезе, требующие приема лекарственных препаратов на момент участия (для пациенток всех групп). Выполнено комплексное обследование всех участниц исследования. С применением метода иммуноцитохимии проведена оценка клеточного состава ряда лимфоцитов периферической крови, в частности CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD19⁺, CD95⁺. Генотип определяли с помощью метода аллельной дискриминации, различия гетерозиготного и гомозиготного вариантов выявляли по характеру реакций амплификации соответствующих праймеров. Материалом для исследования служил мазок со слизистой оболочки ротоглотки. Исследование полиморфизма четырех генов проведено с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени. В качестве праймеров использовали участки ДНК генов eNOS 1799983(Glu298Asp), ApoE rs429358(Cys130Arg), PPARA (G2528C), MTHFR (C677T,A1298C), выполнено определение процентного соотношения гомозиготных и гетерозиготных результатов. Все стадии исследования соответствуют законодательству РФ, международным этическим нормам и нормативным документам исследовательских организаций, все участники также подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Для статистического анализа применялись пакеты прикладных программ Microsoft Excel (2010), StatSoft Statistica 6.0 (StatSoft, США), SPSS Statistics, версия 22.0 (IBM Microsoft, США). Количественные параметры по группам представлены в виде средних значений, медианы (Ме) и процентильного интервала (25–75), для сравнения групп использовались непараметрические методы (тест Манна – Уитни), для анализа взаимосвязей между частотой признаков и межгрупповых различий применяли критерий χ², результаты представлены с 95%-ным доверительным интервалом (Q ± q), рассчитывали отношения шансов (ОШ) и отношения рисков (ОР) с доверительным интервалом (ДИ) 95 %.

Результаты и их обсуждение

Первоначально проведен сравнительный анализ клинических данных пациенток, участвующих в исследовании. Средний возраст участниц соответствовал 30,9 ± 2,1 г. в I группе и 33,5 ± 1,8 г. – во II. Получены следующие особенности акушерско-гинекологического анамнеза в группах: выявлена высокая частота медицинских абортов у женщин как в I, так и во II группах – 24,24 ± 15 и 56,6 ± 13,6 % соответственно (χ² = 7,37; p = 0,007; ОШ 4,07; ДИ 95 % 1,55; 10,6). Неудачные исходы беременности в виде неразвивающейся беременности имели место только у больных II группы – 24,5 ± 11,8 % случаев (χ² = 3,68; p = 0,05); выкидыши зафиксированы у 15,15 ± 12 % пациенток с ХЭ и у 26,4 ± 12,1 % в I группе (χ² = 0,03; p = 0,33; ОШ 2,01; ДИ 95 % 0,65; 6,23). Нарушение фертильности (как первичная, так вторичная форма бесплодия) выявлено только у 56,6 ± 13,6 % пациенток II группы – с ХЭ (χ² = 15,7; p = 0,001); роды в I группе имели 33,33 ± 16 % женщин, во II – 37,8 ± 13,4 % (χ² = 0,86; p = 0,03; ОШ 1,21; ДИ 95 % 0,49; 3,02). Дисплазия молочной железы обнаружена преимущественно у больных ХЭ (χ² = 2,83; p = 0,09, ОР 3,59; ДИ 95 % 0,94; 13,6). Особенности гинекологического анамнеза представлены на рис. 1.

Рис. 1. Особенности гинекологического анамнеза у участниц исследования: * – р < 0,001 – различия статистически значимы

Анализ сопутствующей соматической патологии у пациенток, участвующих в исследовании, продемонстрировал значимые отличия в группе тех, кто имеет ХЭ, результаты представлены на рис. 2. При расчёте рисков развития статистически значимой сопутствующей патологии в группах выявлено, что имеется значимая разница по заболеванию органов пищеварения: в частности, у женщин II группы были выше риски появления синдрома кишечной диспепсии и патологии жёлчного пузыря (χ² = 32,34, p = 0,001, ОР 2,8; ДИ 95 % 1,9; 4,13); хронический тонзиллит диагностировался чаще у больных ХЭ (χ² = 5,77; p = 0,01, ОР 1,63; ДИ 95 % 1,24; 2,14).

Рис. 2. Статистически значимая сопутствующая соматическая патология (%) в группах: * – р < 0,001 – различия статистически значимые

По результатам оценки лимфоцитов периферической крови у практически здоровых и пациенток с ХЭ в анамнезе получены статистически значимые различия, в частности, у больных ХЭ Ме лейкоцитов составила 4,9·10⁹/л (4,6–5,7) по сравнению с группой практически здоровых пациенток: Ме = 6,2·10⁹/л (5,3–6,8) (р = 0,001); Ме количества лимфоцитов соответствовала 1,99·10⁹/л (1,66–2,380) в I группе против 2,42·10⁹/л (2,17–3,01) – во II (р = 0,001) (рис. 3). У 67,9 % пациенток II группы установлены более низкие значения Т-лимфоцитов – CD3⁺-клеток, Ме – 65 % (54–70) против 71 % (69–73) в I группе (р = 0,001). У больных ХЭ выявлено снижение индекса лимфоцитов с фенотипом CD3⁺/CD8⁺ – Ме = 19,5 % (12–29,5) – по сравнению с 25 % (22–31) в I группе (р = 0,004). По результатам анализа CD95⁺ у пациенток с ХЭ получили медиану 0,57·10⁹/л (0,48–0,71) против 0,72·10⁹/л (0,65–0,95) (p < 0,001) – у женщин I группы. В I группы в 24,4 ± 15,3 % (8) случаев имелось снижение показателей CD3⁺/CD95⁺ против 90,57 ± 8,06 % (48) случаев во II группе (χ² = 36,52, p < 0,001; ОР = 5,14; ОР 95 % ДИ 2,29;11,5). У 41,5 ± 13 % больных ХЭ количество лимфоцитов с фенотипом CD3⁺/CD4⁺ было снижено. Соотношение хелперов и супрессоров в периферической крови (CD4⁺/CD8⁺) было снижено у 1/3 пациенток, имеющих ХЭ в анамнезе (28,3 ± 12,4 %). У 32,08 ± 12,9 % женщин с ХЭ количество В-клеток CD19⁺ было меньше, чем у практически здоровых пациенток (9 (6–13) против 14 (13–17) % соответственно, р = 0,001). Между снижением количества CD3⁺-лимфоцитов и CD19⁺ получена слабая, но положительная корреляция (r = 0,03,p < 0,05).

Рис. 3. Сравнительный анализ количества лимфоцитов периферической крови у практически здоровых женщин (I группа) и больных хроническим эндометритом (II группа)

По результатам обследования пациенток установлено, что имеется нормальная гомозигота (G/G) гена ApoE Cys130Arg (rs 429358) у 87,8 ± 11,6 % женщин I группы и у 49,1 ± 13,8 % обследованных II группы (рис. 4), гетерозигота (GС) встретилась у 12,1 ± 11,6 % в I и у 47,2 ± 13,7 % – во II группе (χ² = 11,67; р = 0,001; ОР 1,84; ОР 95%ДИ 1,35; 2,51); патологическая гомозигота (С/С) определена у 3,7 ± 5,3 % пациенток только II группы. Патологическая минорная аллель выявлена у 6,1 % в группе практически здоровых и у 27,4 % пациенток с ХЭ.

Рис. 4. Полиморфизм генов PPARA (rs 4253778), eNOS (rs 1799983), MTHFR (rs 1801133), ApoE (rs 429358) у практически здоровых (I группа) и больных ХЭ (II группа) участниц, %: * – р < 0,001 – различия статистически значимые

Исследование аллельных вариантов полиморфизма G2528C гена PPARA у пациенток I группы показало, что они чаще имеют генотип G/G – 90,9 ± 10,2 % (30), минорная аллель С была выявлена только у 9,09 ± 10,2 % (3) женщин (р < 0,001). Во II группе пациенток с ХЭ в анамнезе с минорной аллелью С было 35,9 ± 13,2 % женщин, с генотипом С/С – 3,7 ± 5,3 % (р < 0,001). Патологическая минорная аллель наблюдалась у 4,5 % здоровых и у 21,7 % больных ХЭ. Таким образом, сравнение результатов частот гетерозиготного, гомозиготного генотипа, нормальной и патологической аллели гена PPARA (rs4253778) G2528C в I и во II группах участниц исследования продемонстрировало статистически значимую разницу между группами по наличию полиморфизма и минорной аллели (χ² = 7,97; р = 0,005; ОШ 6,56; ОШ 95 %ДИ 1,77; 24,3;), расчет рисков также выявил статистическую значимость: ОР 1,69; ОР 95 % ДИ 1,28; 2,25.

Исследование генотипа и аллелей гена eNOS (rs 1799983) Glu298Asp у практически здоровых участниц показало преобладание генотипа G/G над С/С (χ² = 4,58; р = 0,032); результаты исследования аллельных вариантов Glu298Asp гена eNOS в I группе выявили, что мажорная аллель в виде генотипа G/G имеется у 81,8 ± 13,9 % (27) и минорная аллель С в виде генотипа G/С – у 18,2 ± 13,7 % (6) пациенток (р < 0,001). В группе женщин с ХЭ в анамнезе преобладал полиморфизм, минорная аллель С (генотип G/С) была получена у 52,8 ± 13,2 %, в виде С/С (патологической гомозиготы) – у 5,66 ± 6,37 % (3) женщин (р < 0,001). Патологическая минорная аллель имелась в I группе у 9,09 % пациенток и у 32,1 % – во II (р = 0,01). Таким образом, сравнение результатов гетерозиготного, гомозиготного генотипов, нормальной и патологической аллелей по eNOS Glu298Asp (rs1799983) показало статистически значимую разницу между практически здоровыми и пациентками с ХЭ в анамнезе (χ² = 11,9; р = 0,001; ОШ 6,34; ОШ 95 % ДИ 2,24; 17,94), расчет рисков подтвердил статистическую значимость – ОР 1,87; ОР 95 % ДИ 1,33; 2,62.

Результаты исследования полиморфизма гена MTHFR rs1801133 C677T позволили установить, что нормальную гомозиготу (G/G) имели 93,9 ± 8,5 % женщин I группы и 66 ± 13,1 % пациенток II группы, гетерозиготный генотип (G/С) – 6,06 ± 8,4 и 24,5 ± 11,9 % соответственно, что статистически значимо (χ² = 7,4; р = 0,007; ОР 1,69; ОР 95 % ДИ 1,3; 2,22), патологическая гомозигота (С/С) выявлена у 9,43 ± 8,06 % практический здоровых участниц и у 9,4 ± 8,1 % пациенток с ХЭ в анамнезе. Таким образом, сравнение результатов гетерозиготного, гомозиготного генотипов, нормальной и патологической аллелей гена MTHFR rs1801133 C677T показало статистически значимую разницу между практически здоровыми и пациентками с ХЭ в анамнезе (ОШ 7,97; ОШ 95 % ДИ 1,71; 37,1).

В дальнейшем проведен анализ ассоциации между клинико-анамнестическими данными пациенток и наличием полиморфизма гена. Выявлено, что у женщин с ХЭ (II группа), имеющих неразвивающуюся беременность в анамнезе, чаще наблюдался полиморфизм гена ApoE rs429358 (χ² = 3,38, p = 0,06, ОШ 4,5; ОШ 95 % ДИ 1,07; 18,9), расчет рисков также указал на статистическую значимость данных (ОР 1,81; ОР 95 % ДИ 1,13; 2,89). В этой же группе пациентки с изменением генотипа MTHFR rs18011 чаще имели минорные аллели гена PPAR (χ² = 3,75; p = 0,054; ОШ 4,00; ОШ 95 % ДИ 1,16; 13,83), расчет рисков демонстрирует статистическую значимость (ОР 2,313; ОР 95 % ДИ 1,13; 4,72; r = 0,024 (p < 0,05)); полиморфизм гена MTHFR rs1801 во II группе имели пациентки с патологией органов пищеварения в виде хронического холецистита (χ² = 5,99; p = 0,01) и синдрома кишечной диспепсии в анамнезе (χ² = 5,36; p = 0,02). Пациентки II группы с аномальными маточными кровотечениями в анамнезе чаще были носителями минорной аллели гена PPARArs4253778 (ОР 1,968; ОР 95 % ДИ 1,03; 3,76; r = 0,04 (p < 0,05)). У участниц II группы, имеющих хронический холецистит в анамнезе и снижение индекса CD3⁺CD4⁺, чаще наблюдали полиморфизм гена PPARA 4253778 (r = 0,04; ОШ 0,28; ОШ 95 % ДИ 0,08; 0,93). Пациентки со снижением CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов имели полиморфизм генов ApoE 42935(r = 0,02; ОР 1,24; ОШ 95 % ДИ 1,03; 1,49) и eNOS 1799983 (r = 0,05; ОР 0,84; ОШ 95 % ДИ; 0,72; 0,98).

По результатам проведенного исследования установлено, что пациентки с ХЭ чаще имели хронические заболевания органов пищеварения, дыхания, их акушерско-гинекологический анамнез был отягощен сопутствующей хронической патологией других органов, что подчеркивает роль сочетанного характера воспалительных процессов разных органов в патогенезе ХЭ. Выявлены ассоциации изучаемых локусов генов с клиническими данными больных ХЭ. Результаты иммунологического исследования показали признаки недостаточности клеточного эффекторного звена иммунитета у преобладающей части пациенток с ХЭ, при этом они чаще имели полиморфизм генов PPARA 4253778, ApoE42935 и eNOS 1799983.

Предполагаем, что наличие полиморфизма некоторых генов, но отсутствие патологии эндометрия, нарушения фертильности, более низкие показатели заболеваний органов малого таза и органов пищеварения у практически здоровых участниц исследования подтверждают гипотезу о ведущей роли инфекционного фактора в реализации патологических процессов в матке при ХЭ [1–4].

Выводы

1. Получено преобладание полиморфизма генов eNOS 1799983(Glu298Asp), PPARA (G2528C), ApoE rs429358(Cys130Arg), MTHFR (C677T, A1298C) у больных хроническим воспалением эндометрия по сравнению с практически здоровыми участницами исследования.
2. Выявлена недостаточность клеточного эффекторного звена иммунитета у преобладающей части пациенток с ХЭ, установлены ассоциации аллели С генотипа G/C и С/C гена PPARA 4253778, аллели С генотипа G/C и С/C гена ApoE42935, аллели С генотипа G/C и С/C гена eNOS 1799983, генотипа G/C гена MTHFR (C677T, A1298C) с клиническими данными участниц.
3. Результаты исследования показывают, что нужны дальнейшие исследования генов eNOS 1799983, PPARA, ApoE у пациенток с хроническими воспалительными процессами малого таза в анамнезе.

About the authors

E. G. Kobaidze

Author for correspondence.
Email: eka7i@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0001-5042-1549
SPIN-code: 1585-3296
Scopus Author ID: 57219650638

MD, PhD, Professor, Department of Obstetrics and Gynecology № 1

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure 1. Features of the gynecological history in the study participants: * - p <0.001 - the differences are statistically significant

Download (64KB)

Indexing metadata

3. Figure 2. Statistically significant concomitant somatic pathology (%) in the groups: * - p <0.001 - statistically significant differences

Download (13KB)

Indexing metadata

4. Figure 3. Comparative analysis of the number of peripheral blood lymphocytes in apparently healthy women (group I) and patients with chronic endometritis (group II)

Download (31KB)

Indexing metadata

5. Figure 4. Polymorphism of genes PPARA (rs 4253778), eNOS (rs 1799983), MTHFR (rs 1801133), ApoE (rs 429358) in practically healthy (group I) and patients with ChE (group II) participants,%: * - p < 0.001 - statistically significant differences

Download (17KB)

Indexing metadata